LHCGR、FSHR、YAP1DNA多态性与多囊卵巢综合征发病间的相关性研究

宁冰雪，李 霞，王青丽，巩晓芸

（新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心，乌鲁木齐830054）

多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期女性群体常见、多发内分泌及生殖功能障碍性疾病。流行病学数据显示，PCOS 在育龄期女性群体中发病率约5%～10%，是不孕的主要因素之一[1-3]。PCOS 临床表现具有高度异质性，其发病机制尚未明确，目前最佳治疗方案尚存争议，而如何加强PCOS 高危群体筛查，予以早期干预实现“治未病”理念是当前热点课题之一[4-5]。研究发现，PCOS 发病存在家族聚集特征，患者一级家属PCOS 发病风险显著高于正常群体，遗传因素可能在PCOS 发病中起重要作用[6-7]。此外，PCOS 患者存在黄体生成素、卵泡刺激素、Yes相关蛋白1表达异常等情况，但对应基因是否与此疾病发病有关尚无定论[8-10]。本研究采用Logistic回归分析LHCGR、FSHR、YAP1DNA多态性与多囊卵巢综合征（PCOS）发病的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019 年10 月-2021 年2 月新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心PCOS 患者59例作为PCOS组，同期健康体检者59例作为对照组。

1.2 纳入与排除标准[11]纳入标准：（1）PCOS组符合PCOS 诊断标准；（2）年龄25～35 岁；（3）非妊娠状态且近3个月无激素药物应用史，未节食；对照组体健；知情理解本研究，签署同意书。排除标准：（1）卵巢或肾上腺肿瘤、柯兴综合征、先天性肾上腺皮质增殖症；（2）自身免疫性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集 采用非抗凝真空管抽取5 mL 晨空腹肘静脉血，样本在30 min 内送检。自中国国际数据中心选用标签SNP，参数设定少见等位基因频率≥0.1、r2≥0.8，自LHCGR、FSHR、YAP1 基因上游2 000 bp 至下游1 000 bp 区选SNP 位点，引物序列为LHC⁃GR 基因SNP 位点rs13405728：上游5'-TCCCAATAT⁃GTAGTTATTGACTA-3'、下游5'-TTGTCAATATTGC⁃TAAGATTTAGAAACCTGCTCTGGCAGAAGAGGCA ⁃CATCTTG-3'，退火温度52℃；FSHR 基因SNP 位点rs1394205：上 游5'-TTTGTGGTCATCTGTGGCTGC-3'、下游5'-CAAAGGCAAGGACTGAATTTATCATT-3'，退火温度52℃；YAP1 基因SNP 位点rs11225161：上游5'-CGGGTGTGCAAGAACGATATT-3'、下游5'-CCACAGATTACGGAACCATTA-3'，退火温度52℃。

1.3.2 DNA 的扩增 PCR 热循环仪（美国BIO-RAD 公司），50 μL PCR 反应体系，2 μL 模板DNA、缓冲液10×5 μL、4.0μL 2.5 mm dNTP、正反向引物10 pmol 分别2 μL、2×Taq Master Mix 25 μL、去离子水加至50 μL；循环参数：PCR 循环参数：94℃5 min 预变性，94℃30s-72℃，30s-72℃7 min 延伸，共30 个循环。完成扩增反应，2% 琼脂糖凝胶微孔加扩增目的片段5 μL，电压150 V，电泳15 min，凝胶摄像仪拍照，焦磷酸法测序。

1.4 观察指标（1）对比两组一般资料：年龄、体质量指数、生育史、饮食喜好、初潮年龄、家族病史、工作性质、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、睾酮（T）。（2）基因型、Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验。（3）对比两组LHCGR、FSHR、YAP1 基因型频率分布。（4）PCOS发生的Logistic回归方程分析。

1.5 统计学处理采用SPSS25.0 统计学软件进行统计分析，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，计量资料以平均数±标准差（±s）表示，采取Bartlett 方差齐性检验与Kolmogorov－Smirnov 正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态布，两组间比较采用独立样本t检验；采用Logistic回归分析相关因素，均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组一般资料的比较两组患者在年龄、体质指数、生育史、饮食喜好、初潮年龄、家族病史、工作性质基础资料对比，差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组比较，PCOS组LH、T指标升高，FSH指标降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料的比较

2.2 基因型、Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验

LHCGR 基 因SNP 位 点rs13405728、FSHR 基 因SNP 位点rs1394205、YAP1 基因SNP 位点rs11225161基因型分布频率是实际值与理论值符合Hardy-Wein⁃berg遗传平衡定律检验，具有人群代表性（P>0.05）。

2.3 对比两组LHCGR、FSHR、YAP1 基因型频的比较PCOS 组rs13405728 位点基因型TT、TC、CC 频率分别为69.49%、28.81%、1.69%；rs1394205 位点基因型AA、AG、GG 频率分别为59.32%、22.03%、18.64%；rs11225161 基因型AA、AG、GG 频率分别为18.64%、59.32%、22.03%；对照组rs13405728 位点基因型TT、TC、CC 频率分别为50.85%、27.12%、22.03%；rs1394205 位点基因型AA、AG、GG 频率分别为55.93%、20.34%、23.73%；rs11225161 基因型AA、AG、GG 频率分别为44.07%、47.46%、8.47%。 两组rs13405728 位点基因型频率、rs11225161 基因型分布频率对比，差异有统计学意义（P<0.05）；两组rs1394205 位点基因型频率对比，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 对比两组LHCGR、FSHR、YAP1基因型频率分布

2.4 PCOS 发生的Logistic 回归方程分析以FSH、LH、T 为自变量，以是否发生PCOS 作为因变量（赋值见表3），纳入Logistic回归方程，结果显示rs13405728位点基因型、rs11225161 位点基因型多态性均与PCOS发生有关（P<0.05），见表4。

表3 项目赋值表

表4 PCOS发生的Logistic回归方程分析结果

3 讨论

PCOS 主要特点是不排卵或慢性延迟排卵，高雄激素血症和/或B 超见卵巢多囊等，严重影响患者生理及心理健康[12-13]。近年有关PCOS 发病相关因素的研究较多，宋泽丽等[14]研究指出，家族糖尿病史、晚睡或睡眠不规律、缺乏运动等均是PCOS 发病危险因素；还有学者提出，工作压力及精神压力大可增加PCOS 发病风险[15]。但本研究对比是否发生PCOS 群体饮食喜好、工作性质、家族病史等一般资料并无显著差异（P>0.05），提示PCOS 发生可能是多因素、多过程作用的结果，现有研究仍无法客观解释PCOS 发病的具体机制。此外，还有研究表明，PCOS发病可能是多个基因与环境因素共同作用的结果[16]。基于此，本研究结合当前研究热点选取与生殖系统功能相关LHCGR、FSHR、YAP1 基因型进行研究。国外研究显示，FSHR 在FSH 生理功能中具有重要调节作用，其基因突变及多态性可能与卵巢反应性有关[17]。本研究同样发现，FSHR 存在基因多态性，其中以AA 基因型占比59.32% 最高，但基因型分布与对照组对比并无显著差异（P>0.05），与相关研究[18]结果近似，说明此基因型可能与PCOS 发病无直接关系。但还有研究显示，在日本女性中超过65% 的PCOS 患者表现LHCGR 杂合子亚型[19]。同时鉴于FSHR 活性与卵巢反应性关系分析，FSHR 基因型在PCOS 发病中的作用机制可能与种族有关，仍需继续探究。

LHCGR 基因定位于2p16.3 区域，负责编码人绒毛膜促性腺激素，正常情况，LHCGR 激活可调控LH峰以诱发排卵，而LHCGR 失活可致LH 显著升高，表现稀发排卵[20]。本研究结果显示，两组rs13405728位点基因型TT、TC、CC 频率及血清LH 水平有显著差异（P<0.05），此过程与上述研究一致，说明PCOS 患者LH 水平升高及稀发排卵可能与rs13405728位点基因传递有关。YAP1 是Salvador-Warts-Hippo（SWH）信号通路重要下游调控因子，是本身包含保守丝氨酸功能域及两个WW 结构域，并以此结合多种信号通路蛋白而发挥转录调控功能。相关研究证实，PCOS患者卵巢增大、氧化应激及慢性炎症因子表达等病理生理性改变均与YAP1功能存在潜在关联性[21]。本研究结果显示，PCOS 组rs11225161 基因型AG 分布频率59.32%、GG分布频率22.03%高于对照组，AA分布频率18.64% 低于对照组（P<0.05），提示rs11225161传递不平衡可能与PCOS发生有关。结合现有研究分析可能机制是YAP1 受磷酸化控制，其磷酸化后能抑制转录增强相关域调控因子共激活效应继而上调前生长基因，同时YAP1 与p73 结合后亦可特异性激活BAX 等前凋亡基因，此种效应在被AKt磷酸化YAP1 后减弱，而在PCOS 患者子宫内膜不典型增生过程中可观察到上述生理现象[22-23]。由此得出，YAP1 在PCOS 发病过程中参与重要的信号通路调节过程。另外，近年有研究显示，PCOS患者可表现FSH、LH、T 等异常。但本研究经Logistic回归方程分析发现，校正上述因素后，rs13405728 位点基因型、rs11225161 位点基因型多态性均与PCOS 发生有关（P<0.05），分析主要是因FSH、LH、T 可能是PCOS 表现形式，而基因异常是PCOS 发病的根本原因，且临床中部分PCOS 患者性激素六项并无显著异常。上述研究客观说明LHCGR、YAP1 可能是PCOS 的易感基因。

综上可知，LHCGR、YAP1DNA 是PCOS 的易感基因，其中rs13405728 位点T/C 多态、rs11225161 位点A/G多态与PCOS易感性存在关联性。