microRNA-186-5p靶向KLOTHO调控绒毛外滋养细胞侵袭功能的机制研究

薛筱蕾，雷 帝，范翠芳

（1新疆医科大学第五附属医院产科，乌鲁木齐830000；2武汉大学人民医院产科，武汉430060）

子痫前期是一种严重影响母儿生命健康的妊娠期并发症，全球发生率约为3%[1]。过去几十年来子痫前期的基础研究取得了很大进展，但其具体的发病机制仍尚不明确[2]。螺旋动脉重铸异常被认为是子痫前期发病机制中的重要环节，当绒毛外滋养细胞侵袭功能受损，侵入子宫肌层不足，造成螺旋动脉重铸失败，引起胎盘缺血缺氧，诱发子痫前期的发生发展[3-4]。KLOTHO 是一种参与哺乳动物衰老过程的基因，越来越多的研究表明，KLOTHO 可以调控多种生物学功能，包括：细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等。我们的前期研究发现KLOTHO 能通过介导MMP-2和MMP-9 的表达调节绒毛外滋养细胞侵袭能力[5]。这一发现揭示了KLOTHO 在子痫前期发病过程中的潜在作用。进一步通过查询TARGETSCAN 数据库，预测了KLOTHO 的靶基因—miR-186-5p，miR-186-5p 是一种与肿瘤细胞的迁移及侵袭密切相关的单链非编码RNA，有研究表明miR-186-5p 通过靶向PTEN 促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和入侵[6]。最新的研究表明在早发型子痫前期血浆和胎盘中miR-186-5p 表达水平显著增加[7]。然而，miR-186-5p 参与子痫前期发病的机制尚未得到阐明。本研究旨在前期研究的基础上，探索参与子痫前期发病机制中KLOTHO 的上游信号通路，并探讨外周血中miR-186-5p 对子痫前期发生风险的预测价值，以期为子痫前期的早期诊断和治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 样本收集收集2018 年6 月至-2019 年6 月在武汉大学人民医院妇产科剖宫产的35名子痫前期孕妇（子痫前期组）及20名正常孕妇（正常组）的胎盘组织及外周血样本。子痫前期的诊断标准参考中华医学会指南:孕周大于20 周后孕妇收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg，伴随以下任意一项:尿蛋白定量≥0.3 g/24 h,或随机尿蛋白≥(+)，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3;蛋白尿阴性但合并以下任一系统或脏器受损:心、肺、肝、肾等器官损伤, 或消化系统、血液系统的异常改变,胎盘-胎儿受到累及等[8]。纳入标准：单胎妊娠、年龄20～34 岁；排除标准：合并其他内外科疾病或妊娠并发症。

1.2 细胞培养及细胞转染绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo 来自于武汉大学细胞典藏中心。将细胞系接种于含10% 胎牛血清的1640 培养基中，置于37℃二氧化碳培养箱。间隔48 h更换培养液，待细胞繁殖至对数生长期时使用胰酶消化细胞并进行传代培养。使用lipofectamine3000 转染试剂对miR-186-5p 抑制剂及模拟物进行转染，转染时间48 h，转染步骤参照试剂盒说明书。

1.3 实时荧光定量PCR使用Takara RNA 提取试剂盒从胎盘组织及细胞中分离出总RNA，利用Taka⁃ra RNA 逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA, 利用实时荧光定量PCR 仪检测相关基因的表达。反应条件为: 初始变性为95℃持续15 min，1个循环，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，连续40 个循环。基因的相对表达量根据公式2－△△Ct计算，U6 设为miR-186-5p 的内参，GAPDH 设为KLOTHO 的内参。实验使用的引物如表1所示。

表1 引物序列表

1.4 Transwell 细胞侵袭实验24室Transwell板（孔径8 μm）置于冰上预冷，将稀释过的Matrigel 取100 μL平铺于上室中，下室加入500 mL 含10% 胎牛血清的1640 培养基。 在37℃二氧化碳细胞培养箱中静置2 h 促凝固。凝固后上室加入密度为1×105个/mL各组转染细胞悬液200 μL 后置于培养箱内24 h。取出小室，用棉签去除小室内侧膜上细胞，冷丙酮固定15 min，结晶紫染色5 min。随机选取5 个不同的视野，显微镜计数穿膜的细胞数，实验重复3次。

1.5 双荧光素酶报告实验将HTR-8/SVneo 细胞接种于24 孔板，放置细胞培养箱培养24 h，用lipo⁃fectamine3000 转染试剂将miR-186-5p 抑制剂、miR-186-5p 模拟物、KLOTHO 野生型质粒及KLOTHO 突变质粒分别转染至HTR-8/SVneo 细胞中，转染时间为48 h，根据DualLuciferase Peporter Assay System 操作说明检测萤火虫荧光素酶活性，取萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值进行统计分析。

1.6 统计学处理采用SPSS16.0 软件进行数据统计学分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验。单因素方差分析（ANOVA）用于多组间比较。使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）评价诊断效能，利用Hanley-McNeil 方法比较ROC曲线下面积。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象基线资料比较子痫前期组和正常组孕妇年龄、孕周、体质指数、孕期增重等基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05），子痫前期组孕妇收缩压及舒张压显著高于正常组（P<0.05），见表2。

表2 两组研究对象基线资料比较（±s）

表2 两组研究对象基线资料比较（±s）

临床特征年龄/岁孕周/周孕前体质指数/ (kg/m2)当前体质指数/ (kg/m2)孕期增重/kg收缩压/mmHg舒张压/mmHg子痫前期组（n=35）31.03±2.45 36.56±4.21 25.94±4.60 29.87±2.76 14.23±5.21 156.75±16.21 108.36±17.32正常组（n=20）30.19±3.78 40.13±2.81 24.72±3.98 27.53±3.62 12.78±4.64 116.87±22.41 76.29±10.48 t值0.461 1.986 0.793 1.407 1.038 2.374 2.132 P值0.765 0.051 0.423 0.166 0.262 0.036 0.047

2.2 miR-186-5p 在子痫前期孕妇胎盘及血清中的表达情况与正常孕妇相比，子痫前期孕妇胎盘样本中miR-186-5p表达明显增加（P<0.05），子痫前期孕妇血清中miR-186-5p表达明显增加（P<0.05），见图1。

图1 miR-186-5p在子痫前期胎盘组织及血清中的表达

2.3 miR-186-5p 表达对绒毛外滋养细胞HTR-8/SVneo 侵袭能力的影响Transwell 细胞侵袭试验检测转染后的细胞的HTR-8/SVneo侵袭能力，miR-186-5p抑制剂、miR-186-5p模拟物转染的效果见图2A，与对照组相比，miR-186-5p抑制剂组侵入小室下表面的细胞明显增多（P<0.05），miR-186-5p模拟物组侵入小室下表面的细胞明显减少（P<0.05）（图2B、C）。

图2 miR-186-5p表达对绒毛外滋养细胞HTR-8/SVneo侵袭能力的影响

2.4 miR-186-5p 与KLOTHO 靶向关系的验证利用TARGETSCAN 数据库，发现miR-186-5p的靶基因为KLOTHO,其结合位点如图3A 所示。通过qRTPCR 初步检测miR-186-5p 与KLOTHO 表达水平的关系，如图3B 所示，子痫前期患者胎盘组织中miR-186-5p 表达与KLOTHO 表达呈负相关（r=-0.538 ,P<0.05) 。双荧光素酶报告检测发现(图3C)，与对照组相比，miR-186-5p 模拟物与KLOTHO 野生型质粒共转染组中荧光素酶活性强度明显下降（P<0.05），miR-186-5p模拟物与KLOTHO突变质粒共转染组的荧光素酶活性强度无明显差异（P>0.05）。qRT-PCR检测发现miR-186-5p 模拟物显著抑制KLOTHO mRNA 的表达，miR-186-5p 抑制剂显著上调KLOTHO mRNA 的表达（图3D）。Western blot检测发现miR-186-5p 模拟物显著抑制KLOTHO 蛋白的表达，miR-186-5p 抑制剂显著上调KLOTHO 蛋白的表达（图3E）。

图3 miR-186-5p与KLOTHO靶向关系的验证

2.5 血清miR-186-5p 诊断子痫前期的价值ROC曲线分析显示，血清miR-186-5p 诊断子痫前期的最佳截断值为2.05，曲线下面积为0.842（95%CI：0.733～0.951），敏感度、特异性分别为80%、76%，见图4。

图4 血清miR-186-5p诊断子痫前期的ROC曲线

3 讨论

本课题组前期研究发现KLOTHO 可能通过影响绒毛外滋养细胞侵袭能力参与子痫前期发病[5]，本研究中继续探索KLOTHO 潜在的上游调控信号。通过生物信息学分析确定KLOTHO 的潜在目标—miR-186-5p，随后验证了miR-186-5p 在子痫前期中的表达情况，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇胎盘和血清中miR-186-5p 表达水平明显增高。然后在体外细胞实验中，发现miR-186-5p 过度表达使绒毛外滋养细胞的侵袭能力显著降低。血管重铸障碍是子痫前期发病机制的关键，许多与子痫前期相关的miRNA均证实参与血管形成的调控[9]。miR-186-5p 在子痫前期发病机制中的作用尚不明确，最新的研究表明缺氧条件下人类大脑微血管的改造可能与微血管内皮细胞中miR-186-5p表达下降有关[10]。绒毛外滋养细胞入侵子宫肌层是螺旋动脉重铸的必要条件，侵袭不足造成螺旋动脉重铸异常，胎盘缺血缺氧诱发子痫前期，miR-186-5p 具有调控细胞侵袭的功能，miR-186-5p 可通过负调控TBL1XR1 的过度表达抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[11]，Circ_001680 可通过下调miR-186-5p 水平来刺激胶质瘤的侵袭转移能力[12]。在本研究中，miR-186-5p 在子痫前期胎盘和外周血中高表达，并抑制绒毛外滋养细胞的侵袭，表明miR-186-5p 异常表达可能通过螺旋动脉重铸障碍参与子痫前期的发生发展。

鉴于miR-186-5p 和KLOTHO 在滋养细胞侵袭中的重要性，本研究调查了它们之间的关系，通过双荧光素酶报告基因实验提示miR-186-5p与KLOTHO直接结合，表明miR-186-5p 直接靶向调控KLOTHO影响滋养细胞的侵袭，可能在子痫前期胎盘血管重铸失败中起作用。最后，通过ROC曲线分析显示，血清miR-186-5p 诊断子痫前期效能较好，然而作为单一诊断效能稍显不足，在应用于临床中可以联合超声（子宫螺旋动脉彩超）和检验（常用血清学标志物）提高诊断的准确率。此外本研究尚存在一些局限性，如临床样本不够大，未在其他的绒毛外滋养细胞中验证，在今后的研究中应增加样本量和细胞系。总体来说，miR-186-5p 可作为子痫前期诊断及治疗的新靶点。