黄地安消胶囊调控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信号通路改善HepG2细胞胰岛素抵抗*

高家荣，郭明飞，单 莉，魏良兵

[1.安徽中医药大学第一附属医院(国家中医药管理局中药制剂三级实验室)，安徽合肥 230012 ；2. 安徽医科大学第四附属医院]

T2DM是引起高血压、高血糖、胰岛素抵抗等一系列代谢综合征的常见病理基础[1-2]。肝脏是生物代谢的主要器官，对物质的合成、分泌、代谢和排泄起着至关重要的作用[3]。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)作为2型糖尿病发病中的核心病理生理机制一直是研究的热点，胰岛素抵抗是胰岛素作用的靶器官(主要是肝脏、骨骼肌和脂肪组织等)对胰岛素作用的敏感性降低而致血糖含量升高的病理状态[4]。当肝部分胰岛素抵抗时，容易导致肝糖原合成受阻，糖代谢功能紊乱[5-6]。因此，增强胰岛素敏感性、降低血糖水平和改善胰岛素抵抗是治疗T2DM的关键。黄地安消胶囊为安徽中医药大学第一附属医院治疗糖尿病的特色医院制剂，临床应用多年，疗效确切[7-8]，但其对改善胰岛素抵抗的分子机制尚不明确。本文以高糖高胰岛素为诱导条件，探究黄地安消胶囊改善HepG2细胞胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1.1试验药物 黄地安消胶囊处方由麦冬，枇杷叶，三七，葛根等六味中药组成，按组方比例称取适量药材，第一次加入十倍量的水加热回流提取1.5 h，第二次加8倍量的水加热回流提取1 h，合并两次滤液，静止24 h后，过滤，滤液浓缩干燥，制成干浸膏样品，动物灌胃给药时备用。

1.2实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(200.0±10.0)g，购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(皖)2011-002。所有实验动物均饲养于安徽中医药大学第一附属医院实验动物房，每笼5只，光照和黑暗各12 h交替循环。

1.3试剂 高糖DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基噻唑蓝(MTT，Solarbio公司)，0.25 %胰蛋白酶(Amresco公司)，Trizol试剂(上海生工生物技术公司)，甲醇(上海国药化学试剂有限公司)

1.4仪器 MCO-15AC CO2恒温培养箱(SANYO公司)；洁净工作台(苏净安泰)；Neofuge 15R离心机(Heal Force公司);Theymo Forma 381型CO2培养箱(美国);Nikon Eclipse C1荧光显微镜(日本)；Nikon DS-U3成像系统(日本)；BioTek 酶标仪(德国)

1.5方法

1.5.1含药血清制备 大鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组和黄地安消胶囊组，每组各10只。黄地安消胶囊组按照10 g/kg剂量灌胃给药，2次/d。对照组给予等量溶媒。给药周期为3 d，第3 d一次给予全天剂量后1 h，按照2 mL/kg剂量腹腔注射给予水合氯醛进行麻醉，经腹主动脉取血。静止2 h后，4 000 r/min离心15 min，分离血清，放置于56 ℃水浴锅中灭菌30 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.5.2细胞培养和胰岛素抵抗模型建立 将HepG2细胞培养在含10 %灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃，5 %CO2的培养箱中，取对数期的细胞接种于96孔板中，待细胞长至80 %～90 %融合后用于实验。在空白孔中加入无血清DMEM培养液，其余各孔中加入30 mmol/L浓度的高糖溶液，之后在100 mg/L胰岛素中孵育24 h。

1.5.3MTT法测定HepG2的抑制作用 取对数生长期的细胞，用0.25 %胰蛋白酶消化后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培养液将细胞混悬，稀释至8 ×104/mL，接种于96孔培养板，200 μL/孔。细胞贴壁生长后弃培养液，分别加入5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的含药血清和10 %胎牛血清的高糖DMEM培养液，调零孔中不加细胞，只加入200 μl完整培养液。常规培养24 h、48 h后，每孔加入浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，吸取孔中废液，加入DMSO 150 μL/孔，低速振荡10 min，酶标仪490 nm波长测定每个孔的吸光度A。细胞生长抑制率=(1-A给药组/A对照组)×100 %。

1.5.4免疫荧光分析 含药血清处理HepG2细胞24 h，然后将细胞固定在的4 %多聚甲醛/PBS中15 min，浸泡在0.5 %Triton X-100/PBS中20 min，用PBS洗涤3次，用3 %胎牛血清白蛋白(BSA)在PBS中封闭30 min，滴加一抗IRS-1(1∶150)、PI3K(1∶200)、p-Akt(1∶200)、p-GSK-3β(1∶100)，4 ℃孵育过夜后将细胞在PBS中洗涤，然后滴加二抗(1∶500)在37℃下孵育1 h，用DAPI复染细胞核，在荧光显微镜下观察细胞。

1.5.5HepG2细胞IRS-1、PI3K、Akt、GSK-3β mRNA的表达 采用Trizol试剂提取HepG2细胞总RNA，经逆转录酶反转录成cDNA。各引物序列见表1。扩增条件：95 ℃处理10 min，(95 ℃，变性60 s，60 ℃退火延伸30 s)×40个循环。采用相对定量法分析，结果以2-ΔΔCT表示。

1.5.6HepG2细胞p-IRS-1、PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表达 HepG2细胞在PIPA缓冲液中溶解，细胞裂解液后10 000 r/min离心10 min，收集上清液并煮沸5 min，然后用SDS-PAGE分离蛋白，凝胶电泳后转移到PVDF膜，封闭后滴加一抗p-IRS-1(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶5 000)、p-GSK-3β(1∶5 000)和β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，滴加二抗(1∶1 000)在室温下孵育1 h，使用HRP-ECL发光法进行鉴定，并用凝胶成像系统进行分析。

2 结果

2.1含药血清对HepG2细胞增殖的影响 随着血清浓度的增加，抑制率(IR)也升高。细胞代谢和增殖与血清浓度和培养时间呈正相关。当血清浓度超过10 %时，细胞代谢受到明显抑制，出现细胞死亡。比较培养时间、血清浓度和细胞代谢活性的影响，最终将10 %含药血清和培养48 h作为后续实验浓度。见表2。

表2 含药血清对OD和IR的影响

2.2黄地安消胶囊对HepG2细胞IRS-1表达的影响 免疫荧光结果分析表明，p-IRS-1主要在细胞膜上表达，正常细胞中目标蛋白表达明显(图1A，B)。与正常组(Control)相比，模型组(Model)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表达降低；与模型组相比，含药血清组(HDAXC)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表达升高(P<0.05，图1C，1D，1E)。

图1 含药血清对HepG2细胞IRS-1表达的影响

2.3黄地安消胶囊对HepG2细胞PI3K表达的影响 免疫荧光染色结果表明，与正常组相比，模型组PI3K蛋白表达降低(图2A，2B)；与模型组比较，含药血清组PI3K mRNA和蛋白表达均具有增加趋势，差异具有统计学意义(P<0.05，图2C，2D，2E)。

图2 黄地安消胶囊对HepG2细胞PI3K表达的影响

2.4黄地安消胶囊对HepG2细胞Akt表达的影响 免疫荧光分析显示，p-Akt表达主要在细胞膜上，在模型组中表达含量较低(图3A，3B)。与正常组相比，模型组Akt mRNA和p-Akt蛋白表达降低，与模型组相比，含药血清组Akt mRNA和p-Akt蛋白表达升高(P<0.05，图3C，3D，3E)。

2.5黄地安消胶囊对HepG2细胞GSK-3β表达的影响 免疫荧光结果表明p-GSK-3β主要在模型组表达较高(图4A，4B)。与正常组相比，模型组GSK-3β mRNA表达的水平增加，与模型组相比，含药血清组GSK-3β mRNA表达水平降低；与正常组相比，模型组p-GSK-3β蛋白表达增加，与模型组相比，含药血清组p-GSK-3β蛋白表达降低(P<0.05，图3C，3D，3E)。

图4 黄地安消胶囊对HepG2细胞GSK-3β表达的影响

3 讨论

肝脏是葡萄糖输出和糖原合成的主要部位，肝脏胰岛素抵抗易引起高胰岛素血症、糖原合成障碍、脂肪肝以及T2DM等症状产生[9-10]。因此，改善肝脏胰岛素抵抗已成为治疗T2DM等代谢综合征的关键途径[11]。

正常生理条件下，胰岛素经分泌入血后，与肝细胞膜上的特定受体结合，沿着IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发生级联反应，起着调节血糖稳态的作用[12]。在这一传递过程中，胰岛素首先与肝细胞膜上胰岛素受体α亚单位结合，通过激活内源性酪氨酸激酶产生磷酸化效应从而激活β亚单位的活性。胰岛素受体的激活会对IRS-1和PI3K的酪氨酸残基位点磷酸化进行催化[13-14]。在胰岛素抵抗大鼠的肝脏组织中，IRS-1蛋白表达降低，引起肝糖原合成减少，糖异生作用增加，葡萄糖含量升高[15]。通过对C57BL/ksJ-db/db小鼠建立胰岛素抵抗模型发现，经药物治疗后，给药组小鼠IRS-1、PI3K和Akt的表达明显增加，同时肝脏葡萄糖摄取和糖原合成亦具有增加趋势[16]。PI3K/Akt作为胰岛素传递的下游靶点在这一过程中起着至关重要的作用。肝脏中PI3K和Akt蛋白表达水平的上调和PI3K/Akt通路的激活可抑制下游GSK-3β磷酸化的表达，降低GSK-3β活性和表达降低，从而促进GSK-3β蛋白底物GS去磷酸化和过表达[17-18]。GSK-3β受PI3K和AKT的调控，激活的PI3K/Akt可以降低GSK-3β的表达，当PI3K/Akt蛋白的表达降低时，这种现象可以逆转。抑制GSK-3β去磷酸化可增加肝脏中GS的活化和糖原合成[19]。在HepG2细胞模型组中，我们观察到IRS-1、PI3K、Akt的表达降低，GSK-3β的表达增加。上述实验结果均与本实验结果相一致，表明黄地安消胶囊能够增强HepG2细胞的胰岛素信号通路活性，增加葡萄糖摄取，降低血糖水平，缓解糖尿病症状。

综上所述，黄地安消胶囊能够通过调控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β介导的胰岛素信号通路的激活，提高胰岛素信号的传导，促进糖原合成，降低血糖。其结果表明黄地安消胶囊对胰岛素信号通路的传递具有促进作用，其机制可能与其调控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信号通路蛋白活性有关。