不同提取方法对陕产黄精多糖及其抗氧化活性的影响*

王 敏，赵重博，王 晶,4

（1.南京大学医学院附属鼓楼医院，江苏 南京 210008；2.南京临床药学中心，江苏 南京 210008；3.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；4.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046）

黄精来源于百合科植物滇黄精（Polygonatum KingianumColl.et Hemsl.）、黄精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黄精（polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根茎[1]，其中第二种黄精主要分布在陕西汉中地区，以栽培为主，而野生资源遍布秦岭山脉，因其外形似鸡头，又称为“鸡头黄精”，是传统的药食两用中药，具有养阴润肺、滋阴填髓、补脾益气的功效[2]。黄精含有甾体皂苷、黄酮类、蒽醌类和多糖等多种化学成分[3-4]。多糖不仅是其中药用活性较高的一种成分，也是2020年版《中华人民共和国药典》规定的唯一质量控制指标。黄精多糖主要由葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸等组成，具有抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力、降血脂血糖及抗氧化损伤等作用[5-7]。黄精多糖生物活性高，其具有重要开发价值。据此，笔者采用不同方法提取黄精多糖，并采用季铵盐沉淀法分离不同性质的多糖组分，研究其结构特征和抗氧化活性，以期为黄精多糖的深入开发提供依据。

1 材 料

1.1 药物与试剂 黄精药材采自陕西汉中略阳步长集团黄精种植基地，经陕西中医药大学赵重博副教授鉴定为百合科黄精属植物黄精（Polygonatum sibiritumRed）的干燥根茎。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）（批号：Y27M11C 114179）、鼠李糖（批号：H29A10G96375）、木瓜蛋白酶（批号：P15J11B118475）、阿拉伯糖（批号：H24J11C116813）、甘露糖（批号：C25D8H51117）和半乳糖（批号：S09D11M133218）均购自源叶生物有限公司；碳酸氢钠（批号：20200713）、磷酸二氢钾（批号：20200929）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）（批号：20200914）、氯化钠（批号：20200922）、无水乙醇（批号：20201019）、硼酸（批号：20201126）和DPPH（批号：20200217）均购自天津天丽化学试剂有限公司；葡萄糖（批号：20190726）、37.5%盐酸（批号：20200216）、浓硫酸（批号：20190924）、维生素C（VC）（批号：20200104）、溴化钾（批号：20200322）和溴代十六烷基三甲胺（CTAB）（批号：20190918）均购自科密欧化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器DIONEX UItimate3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；UV2550型紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KH-400KDE型高功率数控超声波清洗机（欧莱博科技有限公司）；XJY-2台式高速离心机（上海沪粤明科学仪器有限公司）；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（常州恒隆仪器有限公司）；GB5374-91型电子天平（艾安得仪器有限公司）；HH-X型数显电热恒温水浴锅（西安莫吉娜仪器制造有限公司）；MG-2200型氮吹仪（上海旦鼎国际贸易有限公司）；Tensor-27型博里叶变换红外色谱仪（德国Bruker光谱仪器公司）。

2 方 法

2.1 黄精多糖含量的测定 参照2020年版《中华人民共和国药典》[1]测定黄精多糖含量。

2.2 黄精多糖的提取

2.2.1 样品预处理 取黄精药材细粉（过五号筛）500 g加入5倍量的石油醚，于40℃水浴中回流2 h，过滤，挥干溶剂。残渣中加入药材量10倍量的80%乙醇，于80℃水浴中回流2 h，趁热过滤，残渣用80%乙醇洗涤2次后，挥干溶剂备用。

2.2.2 回流法提取制备黄精多糖粗品参考文献[8]，取“2.2.1”项下的脱脂黄精100 g，加入15倍量的蒸馏水回流2次，每次1 h，合并滤液并浓缩至约200 mL，随后加入95%乙醇至醇量为80%，过夜放置后抽滤，挥干得黄精多糖粗品。

2.2.3 超声法提取制备黄精多糖粗品参考文献[9]，取“2.2.1”项下的脱脂黄精100 g加入15倍量的蒸馏水超声（功率：250 W，频率：40 kHz，温度：50℃）2次，1 h/次，合并滤液并浓缩至约200 mL，随后加入95%乙醇至醇量为80%，过夜放置后抽滤，挥干得黄精多糖粗品。

2.2.4 酶法提取制备黄精多糖粗品参考文献[10]，取“2.2.1”项下的脱脂黄精100 g，加入15倍量的蒸馏水，加入1.5%木瓜蛋白酶，在pH值为6.0和65℃条件下酶解2次，1 h/次，合并滤液并浓缩至约200 mL，随后加入95%乙醇至醇量为80%，过夜放置后抽滤，挥干得黄精多糖粗品。

2.3 黄精多糖的分离纯化

2.3.1 黄精多糖半精品的制备 黄精多糖粗品装入截留量为3 500 Da的透析袋，依次用超纯水和蒸馏水透析24 h和48 h以去除小分子杂质。随后，将所得到的黄精多糖减压浓缩，并且按体积比5∶1加入Sevage试剂[V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1]，涡旋20 min后静置，3 000 r/min离心10 min，移取上层水相。重复4次，向所得水相中加入95%乙醇至含醇量为80%，过夜放置后抽滤，挥干得黄精多糖半精品。

2.3.2 黄精多糖酸性组分的提取 黄精多糖半精品2 g溶于60 mL蒸馏水中，加入50 mL的5%的CTAB，静置2 h后，抽滤收集沉淀。沉淀用10%NaCl溶液溶解后，加入3倍体积95%乙醇后，抽滤收集沉淀。沉淀经溶解、透析和真空冷冻干燥得到黄精多糖酸性组分AP1。

2.3.3 黄精多糖中性组分的提取 将CTAB处理后的上清液用1% H3BO3调至pH值为6.0，再用2 mol/L NaOH溶液调至pH值为11.0，静置2 h，抽滤收集沉淀并用10% NaCl溶液溶解，然后用2%乙酸调至pH值为7.0，加入3倍体积95%乙醇后，抽滤收集沉淀。沉淀经溶解、透析和真空冷冻干燥得到黄精多糖中性组分AP2。

2.3.4 黄精多糖碱性组分的提取 用乙酸将提取AP2后的上清液调至pH值为4.4，加入3倍体积95%乙醇后，抽滤收集沉淀。沉淀经溶解、透析和真空冷冻干燥得到黄精多糖碱性组分AP3。

2.4 黄精多糖的抗氧化活性研究参考文献[10]，分别取系列质量浓度的回流、超声和酶法获得的黄精多糖粗品和不同性质的组分（0.5～8.0mg/mL），以及对照品Vc溶液（0.5～10.1 mg/mL）各0.2 mL，加入1.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液7.8 mL混匀，于515nm处测定吸光度，所有样本均做3个复孔取平均值计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-Ai/AO]×100%。其中Ai为样品加DPPH溶液的吸光度，AO为空白溶液加DPPH溶液的吸光度。

2.5 黄精多糖的结构分析参考文献[11]，黄精多糖粗品20 mg于西林瓶中，加入0.05 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，氮气置换瓶中空气后封口后110℃水解5 h，继而加入甲醇旋蒸，去除三氟乙酸后，再加入超纯水2 mL溶解即得黄精多糖水解样品。向黄精多糖水解样品加入0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L的PMP甲醇溶液各1 mL，混匀后70℃反应30 min，冷却后加入0.3 mol/L的HCl调节至中性，随后使用三氯甲烷反复萃取过量的PMP，移取水层并稀释至5 mL供HPLC进样分析。

HPLC分析条件如下：色谱柱为CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量为10 μL，pH 6.8 0.05 mol/L磷酸缓冲液-乙腈（体积比为82∶18）等度洗脱，柱温为30℃，流速为0.6 mL/min，检测波长为245 nm。

3 结 果

3.1 多糖含量的测定结果 去除小分子杂质和蛋白的黄精多糖半精品190～600 nm波长范围的紫外光谱图见图1，回流、超声和酶法获得的黄精多糖半精品在260 nm和280 nm处均无吸收峰，表明不同提取方法所得到的黄精多糖半精品均不含有蛋白质和核酸[12-13]。

图1 黄精总多糖紫外扫描图

黄精药材经不同提取方法所得的黄精粗品、半精品和不同性质组分的黄精多糖得率见表1。当采用酶法提取时，黄精多糖粗品和半精品得率最高，而回流法对黄精多糖粗品、半精品和不同性质的3个组分得率均最低。

表1 不同提取方法黄精多糖得率（%）

3.2 黄精多糖抗氧化活性结果 以DPPH清除率表征黄精多糖的抗氧化活性[14]。黄精药材经不同提取方法所得的黄精粗品、半精品和不同性质组分的抗氧化结果见图2，其中超声法所得黄精粗品和半精品的抗氧化活性最高，而回流法得到的黄精多糖粗品、半精品和不同性质的3个组分的抗氧化活性均最低。

图2 黄精药材经不同提取方法所得的黄精粗品（A）、半精品（B）和不同性质组分（C）的抗氧化结果

3.3 多糖结构研究

3.3.1 单糖组成结果 回流法、超声法和酶法获得的黄精多糖的单糖组成结果见图3、表2。超声法获得的黄精多糖粗品含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖，回流法获得的黄精多糖粗品不含葡萄糖和半乳糖，酶法获得的黄精多糖粗品不含有葡萄糖。3种提取方法均以岩藻糖单糖摩尔比最高。

图3 空白对照（A）、混合多糖对照品（B）以及回流法（C）、超声法（D）和酶法（E）获得的黄精多糖的单糖组成HPLC谱图

表2 不同提取方法黄精多糖的单糖组成及摩尔比

3.3.2 红外测定结果 回流法、超声法和酶法获得的黄精多糖粗品的红外光谱图见图4，结果表明黄精多糖主要有糖环上的C-H振动吸收峰、O-H振动吸收峰、糖醛酸振动吸收峰、吡喃环的醚键C-O-C振动吸收峰及吡喃糖骨架吸收峰。此外回流法和酶法提取的多糖有水合振动吸收峰，而超声法没有此吸收峰；回流法和超声法提取的黄精多糖存在苷键为β-构型的吸收峰，而酶法提取的多糖不含此吸收峰。

图4 回流法（A）、超声法（B）和酶法（C）获得的黄精多糖红外光谱图

4 讨 论

黄精为药食同源的中草药，具有健脾、润肺、益肾、生津等功效，相继被《名医别录》《本草纲目》和《新修本草》等历代本草所记载。多糖是黄精的主要成分，具有多种生物活性，如抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力、降血脂、降血糖及抗氧化损伤等。

笔者通过比较回流法、超声法和酶法3种方法黄精多糖的结构特征和抗氧化活性，以期为黄精多糖的研究开发提供依据。已有文献报道[10]显示，分别采用果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶提取黄精多糖，木瓜蛋白酶处理后的多糖含量最高，并且有利于后续除去蛋白质杂质，故本实验选择木瓜蛋白酶进行黄精多糖的提取。研究表明，3种方法中酶法所获得的黄精多糖的含量和抗氧化活性均高于超声法，而回流法所得的黄精多糖含量和抗氧化活性最低。无论是单糖组成，还是糖环形式和糖苷键类型，3种提取方法所获得的黄精多糖粗品均比较相似，但略有差别。黄精多糖粗品经季铵盐沉淀法分离得到不同性质多糖，3种提取方法纯化后均以碱性AP3组分的含量最高，超声法所获得的AP3组分抗氧化活性最高。超声提取是利用超声波辐射产生强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、扩散和击碎等多种作用，增加物质分子振动的频率和速度、溶剂的穿透力，从而击破黄精细胞壁的破裂促进多糖进入溶剂，实现多糖的快速、高效提取。与回流提取和酶法相比，超声提取具有无需加热、提取率高、成本低、操作简便，且不破坏化学成分的结构的特点[15-16]。

综上所述，出于对黄精多糖提取效率、抗氧化活性和工艺成本的综合考虑，可选择超声法作为优选的提取方法。