通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠RANKL/RANK/OPG系统及MMP-3、TIMP-1表达的影响*

柳玉佳，欧慧萍，吴伊莹，王莘智，范伏元

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性、慢性破坏性关节炎为主要临床特征的自身免疫疾病[1]。其主要病理生理学特征为滑膜的慢性炎症，并可出现关节软骨和骨质的破坏[2]。如果不积极治疗，可能会导致关节损伤和不可逆转的残疾。随着对RA发病机制的深入研究及早期诊断、早期治疗重要性认识的加强，其治疗策略也发生了重大改变[3]。

RA骨免疫稳态依赖于破骨细胞和成骨细胞之间的平衡。在RA滑膜微环境中，各种促炎因子的分泌与释放，促进了破骨细胞的分化能力，并经由骨免疫微环境募集破骨前体转化为成熟的破骨细胞，参与骨破坏进程[4]。核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB Ligand，RANKL）/核因子κB受体（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）系统和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作为骨稳态维持的重要信号，与RA的进程密切相关。前期研究[5-7]发现，通痹颗粒能够发挥多靶点调控作用，可有效缓解RA关节炎症及骨质破坏，然其具体机制尚未完全明确。本实验通过研究通痹颗粒对胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠RANKL/RANK/OPG系统及MMP-3、基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）-1表达的影响，进而揭示通痹颗粒对RA骨破坏的干预作用及分子机制，以更好地指导临床。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级健康雌性SD大鼠60只，体质量200～250 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。大鼠饲养于通风良好的环境，室温恒定在20～25℃，相对湿度40%～60%，标准光照。本实验已通过湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查，批准号：20201010-35，并严格按照伦理要求进行研究。

1.2 药物与试剂 通痹颗粒，方药组成：当归，黄芪，白芥子，血竭，僵蚕，甘草等，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科提供，并由煎药室制备浓缩为含生药1 g/mL。雷公藤多苷片（湖南千金协力药业有限公司，国药准字Z43020138，规格：10mg/片）；牛Ⅱ型胶原（德国Biofroxx公司，批号：2275）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号：SA-F5881）；兔抗鼠RANKL试剂盒（美国proteintech公司，货号：23408-1-AP）；兔抗鼠RANK试剂盒（美国proteintech公司，货号：111860）；兔抗鼠OPG试剂盒（美国proteintech公司，货号：ab73400）；蛋白分子量标准Marker（美国Sigma公司，货号：V900372）；RIPA裂解液（武汉菁禾生物科技有限公司，货号：P0013B）；BCA蛋白定量试剂盒（武汉菁禾生物科技有限公司，货号：P1260）；RNA提取试剂盒（美国Thermo公司，货号：15596026）；逆转录试剂盒（北京康为世纪公司，货号：CW2569）；MMP-3 ELISA试剂盒（武汉菁禾生物科技有限公司，货号：10374-1-AP）；TIMP-1 ELISA试剂盒（武汉菁禾生物科技有限公司，货号：12899-1-AP）。

1.3 主要仪器PIKOREAL96型荧光定量RCP仪（美国Thermo公司）；1658033型电泳仪（美国Biorad公司）；DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）；BioPrep-24型生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.4 造模与分组 将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组，每组12只。除空白组外，其余4组大鼠行CIA造模，具体如下：牛Ⅱ型胶原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中，并用完全弗氏佐剂乳化，制备成牛Ⅱ型胶原。取制备好的牛Ⅱ型胶原0.2 mg于大鼠尾根部多点皮下注射进行初始免疫，2周后同前法以0.1 mg进行增强免疫，4周后进行CIA模型评判。保证注射免疫后大鼠关节炎指数评分≥6分，则为造模成功。

1.5 实验给药 造模成功后，药物均按照人-大鼠体表面积换算为等效剂量，通痹颗粒低剂量组为换算后等效人临床剂量，通痹颗粒高剂量组为等效人临床剂量的2倍。换算后雷公藤多苷组大鼠灌胃雷公藤多苷溶液，给药剂量为0.024 g/（kg·d）；通痹颗粒低、高剂量组大鼠灌胃给予通痹颗粒溶液，给药剂量分别为9.600、19.200 g/（kg·d）；空白组、模型组大鼠予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续2周。

1.6 观察指标 关节炎指数评分和关节肿胀度测量分别于治疗第0、7、14天进行。治疗第14天后所有大鼠脱颈处死，腹主动脉采血，3 000 r/min离心20 min，取上层血清-80℃条件封存，用于血清MMP-3、TIMP-1水平检测；左膝关节滑膜组织剥离，福尔马林液固定，用于滑膜组织病理形态学观察；右膝关节滑膜组织剥离，放入液氮中速冻，-80℃条件下封存，用于滑膜RANKL、RANK、OPG的mRNA和蛋白检测。

1.6.1 关节炎指数评分 根据大鼠关节受累情况进行评分，具体如下：关节无任何红肿为0分，红肿仅累及足趾关节为1分，红肿累及足底及足趾为2分，红肿累及踝关节以下为3分，红肿蔓延至全部足踝关节为4分。4个关节的评分累加即为大鼠的关节炎指数，最大值为16分。

1.6.2 关节肿胀度测量 各组大鼠双后踝关节同一位置做浸水线标记，采用足跖肿胀度测量仪测量大鼠的足跖容积，以其变化情况来估测关节肿胀度。

1.6.3 滑膜组织病理学观察 取固定好的大鼠左膝滑膜组织，EDTA溶液脱钙，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片厚度约5 μm，并行组织HE染色，中性树脂封片，光学显微镜下（×200）观察其组织病理学形态。

1.6.4 滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA表达检测 取右膝滑膜组织，使用Trizol法提取总RNA，行RNA浓度及纯度测定，并以组织总的mRNA为模板用逆转录试剂盒获取互补的cDNA，后使用RT-PCR技术进行基因扩增和检测。反应条件：95℃预变性10 min，95℃15 s→60℃30 s，扩增40个循环。收集荧光得到的曲线图，以β-actin为内参，用实时荧光定量PCR程序分析，采用2-△△ct法计算目的RNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6.5 滑膜组织RANKL、RANK、OPG蛋白表达检测 将低温保存的滑膜组织粉碎，采用Western blotting法，加入RIPA冰上裂解后匀浆离心取上清，严格按照BCA法测定各样品蛋白浓度，并行SDS-PAGE电泳，恒流转印于NC膜后封闭过夜，加入一抗室温孵育90 min，PBST洗膜3次；二抗室温孵育90 min，PBST洗膜3次，ECL显色曝光。曝光后底片扫满，以β-actin为内参，用Quantity one专业灰度分析软件分析条带分子量及灰度值。

1.6.6 血清中MMP-3、TIMP-1水平检测 离心好的血清室温静置，使用ELISA法测定血清中MMP-3、TIMP-1水平，具体操作按照说明书进行。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，并行正态分布和单因素方差分析。若方差齐则以LSD检验进行比较；方差不齐则采用Tamhane’T2法。不同时间点的比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠关节炎指数评分比较 治疗前，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠关节炎指数评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。大鼠关节炎指数评分不同时间比较，差异有统计学意义（F=7.512，P=0.000），即存在时间效应，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组均如此；各组大鼠关节炎指数评分整体比较，差异有统计学意义（F=33.709，P=0.000），即存在分组效应；与空白组比较，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠治疗第0、7、14天关节炎指数评分均升高（P<0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠治疗第7、14天关节炎指数评分均降低（P<0.05）；通痹颗粒低剂量组大鼠治疗第14天关节炎指数评分与雷公藤多苷组比较，差异无统计学意义（P>0.05），通痹颗粒高剂量组大鼠关节炎指数评分低于雷公藤多苷组（P<0.05）。时间因素与分组因素存在交互效应（F=9.214，P=0.000）。（见表2、图1）

表2 各组大鼠关节炎指数评分比较s，分）

表2 各组大鼠关节炎指数评分比较s，分）

注：F时间主效应=7.512，P时间主效应=0.000；F分组主效应=33.709，P分组主效应=0.000；F交互效应=9.214，P交互效应=0.000；与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与雷公藤多苷组比较，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量[g/(kg·d)]治疗第0天 治疗第7天 治疗第14天 F P空白组 12 - 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.352 0.721模型组 12 - 8.67±1.07a 8.93±0.60a 8.75±0.17a 3.738 0.383雷公藤多苷组 12 0.024 8.69±0.76a 7.58±0.56a b 6.07±0.65a b 14.512 0.000通痹颗粒低剂量组12 9.600 8.67±0.97a 7.62±0.79a b 6.11±0.49a b 11.764 0.000通痹颗粒高剂量组12 19.200 8.66±0.84a 7.53±0.76a b 5.31±0.28a b c 17.043 0.000 F 15.961 30.118 36.732 P 0.633 0.002 0.000

2.2 各组大鼠关节肿胀度比较 大鼠关节肿胀度不同时间比较，差异有统计学意义（F=4.373，P=0.000），即存在时间效应，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组均如此；各组大鼠关节肿胀度整体比较，差异有统计学意义（F=26.728，P=0.000），即存在分组效应；与空白组比较，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠治疗第0、7、14天关节肿胀均升高（P<0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠治疗第7、14天关节肿胀度均降低（P<0.05）；通痹颗粒低剂量组大鼠治疗第14天关节肿胀度与雷公藤多苷组比较，差异无统计学意义（P>0.05），通痹颗粒高剂量组大鼠关节肿胀度低于雷公藤多苷组（P<0.05）。时间因素与分组因素存在交互效应（F=7.921，P=0.000）。（见表3、图2）

表3 各组大鼠关节肿胀度比较±s，mL）

表3 各组大鼠关节肿胀度比较±s，mL）

注：F时间主效应=4.373，P时间主效应=0.000；F分组主效应=26.728，P分组主效应=0.000；F交互效应=7.921，P交互效应=0.000；与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与雷公藤多苷组比较，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量[g/(kg·d)]治疗第0天 治疗第7天 治疗第14天F P空白组 12 - 3.21±0.15 3.19±0.32 3.22±0.55 1.142 0.564模型组 12 - 4.27±0.28a 4.35±0.13a 4.13±0.57a 5.871 0.293雷公藤多苷组 12 0.024 4.25±0.17a 3.91±0.51ab 3.68±0.36ab 12.057 0.000通痹颗粒低剂量组12 9.600 4.28±0.18a 3.96±0.29ab 3.71±0.49ab 9.549 0.000通痹颗粒高剂量组12 19.200 4.26±0.23a 3.83±0.37ab 3.49±0.12abc 16.374 0.000 F 35.682 63.947 78.673 P 0.761 0.002 0.000

2.3 各组大鼠滑膜组织病理学改变情况 空白组大鼠滑膜形态正常，细胞排列整齐，未见滑膜增厚及血管新生；模型组大鼠滑膜重度增生，可见缺损及血管翳形成；雷公藤多苷组大鼠滑膜稍厚，可见轻度血管新生及少量炎症细胞浸润；通痹颗粒低剂量组大鼠滑膜中度增厚，可见轻度血管新生及少量炎症细胞浸润；通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜轻度增厚，血管新生不明显，但可见少量炎症细胞浸润。提示经过治疗后，CIA大鼠滑膜病变有所改善，雷公藤多苷组和通痹颗粒高剂量组优于通痹颗粒低剂量组。（见图3）

图3 各组大鼠滑膜组织病理学比较（HE，×200）

2.4 各组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相对表达量比较 与空白组比较，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA相对表达量明显升高（P<0.05），OPG mRNA相对表达量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA相对表达量明显降低（P<0.05），OPG mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；且通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA相对表达量明显低于雷公藤多苷组（P<0.05），OPG mRNA相对表达量明显高于雷公藤多苷组（P<0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相对表达量比较

表4 各组大鼠滑膜组织RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相对表达量比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与雷公藤多苷组比较，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量[g/(kg·d)]RANKL mRNA RANK mRNA OPG mRNA空白组 12 - 1.12±0.05 1.05±0.14 2.72±0.05模型组 12 - 2.78±0.12a 3.28±0.21a 1.31±0.17a雷公藤多苷组 12 0.024 1.79±0.16ab 1.67±0.17ab 1.85±0.07ab通痹颗粒低剂量组12 9.600 2.18±0.09ab 2.17±0.19ab 1.67±0.15ab通痹颗粒高剂量组12 19.200 1.46±0.07abc 1.31±0.08abc 2.18±0.12abc

2.5 各组大鼠滑膜组织RANKL、RANK、OPG蛋白相对表达量比较 与空白组比较，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL、RANK蛋白相对表达量明显升高（P<0.05），OPG蛋白相对表达量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL、RANK蛋白相对表达量明显降低（P<0.05），OPG蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；且通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANKL、RANK蛋白相对表达量明显低于雷公藤多苷组（P<0.05），OPG蛋白相对表达量明显高于雷公藤多苷组（P<0.05）。（见图4、表5）

图4 各组大鼠滑膜组织蛋白Western blotting条带

表5 各组大鼠滑膜组织RANKL、RANK、OPG蛋白相对表达量比较）

表5 各组大鼠滑膜组织RANKL、RANK、OPG蛋白相对表达量比较）

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与雷公藤多苷组比较，cP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量[g/(kg·d)] RANKL RANK OPG空白组 12 - 1.65±0.13 0.14±0.02 0.76±0.03模型组 12 - 4.73±0.17a 0.59±0.04a 0.11±0.06a雷公藤多苷组 12 0.024 3.54±0.09ab 0.27±0.05ab 0.47±0.07ab通痹颗粒低剂量组12 9.600 3.61±0.14ab 0.31±0.01ab 0.41±0.05ab通痹颗粒高剂量组12 19.200 3.22±0.08abc 0.24±0.06abc 0.56±0.01abc

2.6 各组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比较 与空白组比较，模型组、雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明显降低（P<0.05）；且通痹颗粒高剂量组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平低于雷公藤多苷组（P<0.05）。（见表6）

表6 各组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比较（s，pg/mL）

表6 各组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比较（s，pg/mL）

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与雷公藤多苷组比较，cP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[g/(kg·d)] MMP-3 TIMP-1空白组 12 - 73.57±1.98 69.38±2.26模型组 12 - 87.35±2.23a 83.16±2.07a雷公藤多苷组 12 0.024 81.05±2.08ab 75.96±1.95ab通痹颗粒低剂量组12 9.600 83.72±1.52ab 79.44±2.06ab通痹颗粒高剂量组12 19.200 80.87±2.54abc 72.63±2.14abc

3 讨 论

类风湿关节炎（RA）的病理特征为滑膜组织中过量促炎因子的产生，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。这些促炎因子不仅可以诱发MMPs的产生引起关节破坏，还可以经由RANK/RANKL/OPG系统激活成骨细胞或基质细胞生成RANKL，进而出现炎症性骨侵蚀[8]。

RA骨免疫重塑异常会导致吸收增加，从而引起骨质流失和骨化减少，并进一步抑制骨修复而出现骨破坏[9]。破骨细胞是RA患者骨重塑失衡的主要细胞群，而作为其产生及活化的重要调控途径，RANK/RANKL/OPG系统发挥了重要作用。RANK的表达主要发生在破骨细胞中，而其活化因子配体RANKL则以跨膜蛋白形式广泛表达于不同的骨细胞（成骨细胞和破骨细胞）及免疫系统的不同细胞亚群中，主要来源于RA的滑膜组织[10]。一旦RANKL与其受体RANK结合，破骨细胞的生成就会增加，从而发生骨免疫重塑异常导致骨质流失，进一步引起RA骨侵蚀。OPG是一种由基质细胞和破骨细胞分泌的RANKL可溶性受体，它可以抑制RANKL与RANK的结合，从而妨碍破骨细胞生成和骨吸收[11]。因此，RANK/RANKL/OPG系统是调节RA骨免疫代谢的重要途径，抑制RANKL可能是预防RA骨侵蚀的潜在治疗靶点[12]。MMPs是由成纤维样滑膜细胞分泌的一组内肽酶，可以降解细胞外基质蛋白，并对RA具有直接降解软骨和骨质的作用[13]。其中，MMP-3作为MMPs的重要组成成分，除了积极广泛参与RA的关节破坏外[14]，还能够准确预测RA早期阶段的关节损伤情况，并能监测疾病的活动[15]。另外，MMP-3还可与其特异性产物TIMP-1结合，继而通过MMP-3的活化发挥对血管侵袭和滑膜炎症细胞浸润的调控作用，两者的一致性对于RA临床预后有着显著影响[16]。

RA属中医学“历节病”“鹤膝风”等范畴，现多以“尫痹”命名。《黄帝内经》云：“邪之所凑，其气必虚”，《济生方》亦载：“皆因体虚，腠理空疏，受风寒湿气而成痹也”。正虚是尫痹发病的内在原因，正气不足，腠理疏松，则易感邪而为痹[17]。《医级·杂病》曰：“痹非三气，患在痰瘀”，外邪痹阻经脉关节，气血运行失畅，久则化为痰浊、瘀血，以致筋骨肌肉失于濡养，甚则僵硬强直、屈伸不利，最终形成疑难顽疾。本课题组结合前期研究[18]，提出了从“虚、瘀、痰”论治RA。据此研制出益气养血、化痰逐瘀的协定方剂通痹颗粒，由当归、黄芪、血竭、白芥子、僵蚕、甘草等组成。方中重用当归为君，温筋止痛，养血活血。黄芪甘温为臣，大补肺脾元气；与当归相伍，共资气血生化之源。僵蚕治风化痰，散结通经；血竭散瘀定痛，散滞和血；白芥子利气豁痰，暖中散肿；三者皆为佐药。以甘草为使，益气健脾，调和诸药。本实验研究发现，时间与组别的交互效应对CIA大鼠关节炎指数评分和关节肿胀度均有影响，经过治疗后，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠关节炎指数评分和关节肿胀度均降低，治疗第14天通痹颗粒高剂量组优于雷公藤多苷组；经治疗后雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜病变均有改善，雷公藤多苷组和通痹颗粒高剂量组优于通痹颗粒低剂量组。另外，本实验对CIA大鼠骨代谢的进一步研究发现，与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠滑膜组织RANK、RANKL的mRNA和蛋白相对表达量明显降低，OPG mRNA和蛋白相对表达量明显升高，且通痹颗粒高剂量组优于雷公藤多苷组，提示通痹颗粒可以通过下调RANK、RANKL，上调OPG的表达来发挥对RANKL/RANK/OPG系统的调节作用。同时，与模型组比较，雷公藤多苷组、通痹颗粒低剂量组、通痹颗粒高剂量组大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明显降低，且通痹颗粒高剂量组优于雷公藤多苷组，提示通痹颗粒能有效平衡CIA大鼠血清中MMP-3和TIMP-1的异常表达。

综上所述，通痹颗粒能够减轻CIA大鼠的关节炎症，并对关节破坏具有一定的缓解作用，其机制可能与经由RANKL/RANK/OPG系统和MMPs调控骨代谢的作用有关。另外，本研究还发现通痹颗粒对于CIA大鼠的治疗呈现一定的剂量依赖性，即通痹颗粒高剂量组优于通痹颗粒低剂量组，但其临床应用中是否也存在一定的剂量相关性，将是我们接下来重点研究的内容。下一步我们将进一步结合临床，并从细胞分子水平探讨通痹颗粒对RA的治疗作用及其相关机制。