基于网络药理学探讨丹参-黄芪-川芎配伍治疗冠心病心绞痛的作用机制

张 淼，李丹丹，马 民，金 宇，陈启庭，殷惠军

安德鲁 · L · 霍普金斯首先提出了网络药理学的概念[1-2]。近年来，中医中药研究也开始与网络药理学及现代医学等多学科进行融合，对中医药网络药理学这一比较新兴的交叉学科的形成以及推广应用起到了助力的作用[3]。中医讲究整体论治，而大多数的中医药制剂成分结构较为复杂，靶点作用机制尚不清晰。目前，中医中药对疾病的治疗大多认为是一个复杂且涉及多靶点、多组分的过程，中医药网络药理学可以对上述中医中药在治疗临床疾病中的有关基因网络的多靶点复杂协同作用进行初步的评价及分析，通过相关数据库的信息，构建、识别以及分析疾病/药物相关的网络及其有关信号通路，这对进一步探讨和研究传统医药治疗疾病时的具体作用机制有重要意义[4]。冠心病心绞痛的发生发展是一个多基因参与、多阶段、多因素的复杂过程，该病的病理机制主要有异常血管状态、血栓形成、血液黏度增高、血小板活化及聚集等[5]，气虚血瘀证是冠心病心绞痛在传统医学临床中最常见的一种证候类型，治以益气活血，此法应用广泛、疗效明确[6]。益气活血常用中药中，丹参活血化瘀，黄芪益气补养心气，川芎行气活血止痛，三药合用活血而不耗气，益气而不壅滞，在中医临床上作为防治冠心病心绞痛的有效药物被广泛配伍使用，但益气活血类中药的有效活性组分以及这些组分的效应靶点、药理学机制目前仍然不明确。本研究利用网络药理学的方法预测和分析丹参-黄芪-川芎配伍发挥治疗冠心病心绞痛作用的可能靶点、活性成分以及信号通路，为深入探讨丹参-黄芪-川芎改善冠心病心绞痛的分子机制奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 潜在靶点网络的构建 通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索丹参、黄芪、川芎的靶点及其所有活性成分。设置丹参、川芎的筛选条件为类药性(DL)>0.18以及口服利用度(OB)>30%；黄芪的筛选条件为DL>0.18和OB>40%。使用Cytoscape 3.7.0软件构建网络。

1.2 构建成分-靶点网络 Cytoscape 3.7.0软件具有Merge功能，利用该功能对疾病-药物共同的靶点进行分析。

1.3 构建冠心病心绞痛靶点网络 以“angina pectoris”为关键词，分别在DrugBank、TTD(Therapeutic Target Database)和PharmgKb数据库进行检索，得到疾病靶点，在Uniprot平台上转换基因蛋白名，对疾病靶点的可视化网络采用Cytoscape 3.7.0软件构建。

1.4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集通路可视化分析 利用DAVID数据库，分析疾病-药物的共同靶点的KEGG富集途径。

2 结 果

2.1 丹参、黄芪、川芎成分潜在靶点网络 通过检索以及对相关指标的设置，将得到85个药物效用活性组分进行构建，获得包含了243个节点的丹参-黄芪-川芎的靶点可视化网络。用长方形代表靶点，菱形代表成分，丹参的活性组分使用红色表示，黄芪的活性组分使用黄色表示，川芎的活性组分则使用绿色表示。详见图1。

图1 黄芪-丹参-川芎配伍的成分-潜在靶点网络

2.2 冠心病心绞痛靶点网络 通过检索关键词“angina pectoris”，获得疾病的直接靶点共有30个，在UniProt平台将蛋白名转换为标准基因名，再进行构建，之后得到可视化网络图(见图2)，冠心病心绞痛的30个直接靶点具体包括：FGF4、TBXA2R、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、F10、PDE5A、ADRB3、CPT1B、ITGB3、ITGA2B、SCN3A、KCNA5、SLC29A1、KCNH2、ADRB1、CACNA1H、F8、TBXAS1、SLC9A1、ADRB1、HGF、DRD2、P2RY12、PON1、HCN1、SLC9A3、NOS3、CACNA1C、VEGFD。详见表1。

图2 疾病靶点可视化网络图

表1 30个疾病直接靶点

2.3 成分-疾病靶点网络 对丹参-黄芪-川芎的 “疾病靶蛋白-蛋白质相互作用网络” 以及 “组分潜在靶点网络”进行进一步的分析，生成 “成分-疾病靶点网络”图(见图3，椭圆表示效用活性组分，菱形则表示靶点)，成分-疾病靶点网络的靶点有13个，其中包括7个活性成分(分别为 MOL000098、MOL007145、MOL000371、MOL000378、MOL007049、MOL007122、MOL007154)以及6个疾病靶点(分别为 ADRB1、ITGB3、PON1、ADRA2B、ADRA2A、ADRA2C)。

图3 有效成分靶点网络图

2.4 KEGG富集通路信息 对13个靶点进行富集分析获得3条信号通路(见表2)，作用于这3条信号通路的活性成分共有11个(见表3)。

表2 共同靶点KEGG富集信息

表3 作用于活化通路靶点的活性成分

3 讨 论

整体观念和辨证论治是传统医学的重要特点，中药基于传统医学的以上特点在分子水平上通过多靶点、多组分达到治疗目的。作为中医药与网络药理学的交叉学科，中医药网络药理学已成为一种相对比较新的研究范式，广泛应用于对中药作用机制的探索、解释[7]。它可通过生物网络以及分子层面对中医药的作用机制进行深入的探讨，推进中医药的科学化、国际化以及现代化。临床治疗冠心病心绞痛的常用中药为丹参、黄芪、川芎，三药合用较单独使用能协同增强益气和活血的功效。本研究利用网络药理学的研究方法，筛选分析得到85个活性成分以及243个靶点，与冠心病心绞痛的30个直接靶点进行相互映射，得到共同靶点13个，再通过对这13个共同靶点进行KEGG通路富集分析，获得了3条相关的信号通路，共有11个活性组分可以作用于这3条相关信号通路。充分体现了中医药治疗疾病的系统性、整体性、多靶点、多途径、多成分的优势特点，同时发现，在治疗疾病过程中，同一有效成分可以激活不同的信号通路和靶点，不同的有效成分也可以激活同一靶点，从而起到治疗作用，这对中医治疗的异病同治、同病异治的作用机制进行了科学客观的解释[8]。

益气活血类中药被传统医学广泛应用于冠心病心绞痛的防治中。丛敬等[9]研究表明，益气活血类中药对冠心病心绞痛病人预后的改善以及治疗效果的提高均有显著的影响；蔡常青等[10]深入探讨了益气活血中药治疗冠心病心绞痛的具体作用机制，发现可能与减弱病人血液黏滞度、抑制血栓形成、降低炎性因子的释放以及对抗血小板聚集等相关。本研究筛选出丹参-黄芪-川芎配伍治疗冠心病心绞痛的关键活性成分有4-亚甲丹参新酮、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇、丹参酮ⅡA、丹参新酮、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、鼠尾草酚酮和槲皮素等。魏星等[11]研究表明，能作用于信号通路的槲皮素(来源于黄芪的有效组分)也具有明显的改善炎症反应和抑制细菌的作用。Wang等[12]研究表明，丹参新酮(来源于丹参中的有效组分)也已被证明具有降低炎症反应的作用。

本研究结果表示，丹参-黄芪-川芎配伍治疗冠心病心绞痛的关键靶点主要有ITGB3、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRA2A、PON1。生物功能主要涉及细胞炎症反应、细胞增殖和凋亡、对雌二醇的反应、缺氧反应、基因表达、信号转导、药物反应、蛋白质磷酸化等生物学过程。基因ITGB3(GPⅡb/Ⅲa整合素)为最丰富的血小板特异性糖蛋白，有两个亚单位异二聚体(αIIB链和β3链)，影响血栓形成，ITGB3作为配体受体，在血管壁细胞外基质与血小板相互结合的作用中至关重要，且能进一步促进血小板聚集[12]。血小板聚集是血管壁重塑以及形成血栓的关键步骤，在静止血小板中，αIIbβ3糖蛋白的构象不允许配体结合，血小板的激活会引发糖蛋白细胞质的部分结构发生变化，从而使纤维蛋白原受体的结合部位被暴露，通过与其配体中的精氨酸、门冬氨酸、甘氨酸三肽发生结合，进而导致血小板聚集增加[13]。Kucharska-Newton等[14]研究表明，阿司匹林的低反应性可以通过ITGB3 基因rs5918(PlA)单核苷酸的多态性来进行预测。最常见的血小板多态性在GPⅢa蛋白(β3链)中，与RGD的结合序列位于同一区域，称为PlA1/PlA2多态性或Leu33Pro多态性，这种遗传变异与冠心病心绞痛终点之间的相关性已经受到专家学者的重视与关注。本研究结果发现，活性成分丹参酮ⅡA、4-亚甲丹参新酮可以直接作用于ITGB3，推测黄芪、丹参可能通过抗血栓功能发挥其治疗作用。

本研究结果发现，环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路、扩张型心肌病、神经活性配体-受体相互作用这3条通路可能与丹参-黄芪-川芎改善冠心病心绞痛相关。苑晓烨等[15]研究提示cGMP-PKG信号通路在抑制血管钙化、保护心肌等方面作用效果明确。ADRA2B、ADRA2C、ADRA2A、ADRB1分别是cGMP-PKG信号通路富集的4个靶点。ADRA2A(基因肾上腺素能受体基因)、ADRA2C以及ADRA2B均为G蛋白偶联受体的亚家族成员，赵善德[16]研究表明，上述受体与有氧耐力有一定的相关性，且在调控中枢神经系统方面起到关键的作用，主要是影响肾上腺素能神经元以及交感神经相关递质的释放。本研究中丹参酮ⅡA的DL以及OB均较高，并且可以直接作用于ADRA2A靶点，故推断丹参酮ⅡA可能是发挥治疗作用的一个主要组分。苏梅等[17]研究表明，丹参酮ⅡA可升高血管内皮生长因子A(VEGF-A)mRNA水平，促进血管生成；可减少诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-6(IL-6)和环氧合酶-2(COX-2)等炎症相关基因的表达，降低巨噬细胞炎症介质的释放和生成，从而减轻炎症反应；还能通过调控细胞自噬以及凋亡保护心肌细胞。本研究发现，活性组分4-亚甲丹参新酮、丹参新酮、槲皮素、丹参酮ⅡA等能够直接作用cGMP-PKG通路，说明这些活性成分也可能具有干预心肌细胞凋亡、改善心肌供血、调控炎性因子表达等作用。由此可见，丹参-黄芪-川芎可能通过调控多个通路改善冠心病心绞痛的发生发展。

本研究系统地探讨了丹参-黄芪-川芎改善冠心病心绞痛的分子机制，整体描述了中药与疾病的相互作用关系，发现丹参-黄芪-川芎中的槲皮素、丹参酮ⅡA可能是发挥效用的物质基础，可通过调控多个靶点、通路发挥抑制血栓形成、对抗血小板活化、改善脂质代谢、减轻炎症反应、减轻冠状动脉微环境缺血缺氧状态作用，进而稳定斑块，从多角度、多层次参与到冠心病心绞痛的疗效改善及组织修复。今后需补充完善相关的文献，并设计相应的体内或体外实验，以验证本研究结果。

4 小 结

综上所述，中医药组方的多靶点、多组分的特点在改善冠心病心绞痛等慢性复杂疾病方面凸显出了其独特的作用优势。药物的发现通常是从传统药物和临床常用药物中获得启示以及资源，中药网络药理学是对中医药中关键活性组分与疾病相关的靶点在细胞网络环境里的作用进行科学的探索分析，可以为科研和临床工作者更好地了解中药的协调性、整体性以及互补性等特征提供极大的帮助。Kim等[18]的研究表明，了解天然化合物/活性成分与人体代谢产物的结构类似性有助于解释中药的作用方式，进而提出并解释了以天然化合物/活性成分为中心的观点。希望这一鼓舞人心的工作能为中医学研究带来新的方法和新的见解，也希望中医药网络药理学能够为发现新的多靶点、多组分的传统中药以及联合用药提供更多有益的参考和启示。