基于网络药理学分析参附苓桂术甘汤加减治疗缺血性心肌病的药理过程和分子机制

全无瑕，缪延栋

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy，ICM)是由冠状动脉狭窄、阻塞等引起心肌坏死、重构，导致左室舒缩功能障碍的一类疾病，是心力衰竭最常见和最致命的原因[1]。中医药作为我国最受欢迎的补充和替代医学模式之一，因其疗效明显、资源丰富、毒性低而逐渐被外国人所接受，并在西方国家得到越来越多的应用[2-3]。在ICM的临床治疗中，有许多中成药、中药汤剂和中药注射剂单独或作为常规治疗的辅助药物[4-6]。

参附汤和苓桂术甘汤都是常用的中药方剂。参附汤由人参和附子两味中药组成，广泛应用于慢性心力衰竭治疗[7]。苓桂术甘汤由茯苓、桂枝、白术、甘草四味中药组成，不仅可用于治疗ICM，而且在二级预防方面发挥不可替代的作用[5]。黄芪是豆科黄芪属植物，广泛应用于多种疾病的治疗，其中包括ICM[8-9]。在临床上，对部分心肾阳虚证的病人，推荐采用参附汤合苓桂术甘汤加减治疗，其组方主要为人参(红参)、炮附子、黄芪、茯苓、桂枝、白术、泽泻、车前子等[10-11]。然而，该中药汤剂治疗心脏病，特别是ICM的药理过程和分子机制尚未明确。本研究利用网络药理学方法，以参附汤合苓桂术甘汤加减治疗ICM作为研究对象，对药物治疗靶点进行发掘，通过构建一个特定的“中药活性成分-靶点-药理”的复方调控网络，评价中药的合理性和相容性。探究参附汤合苓桂术甘汤加减治疗ICM的活性成分和潜在的靶基因以及基因相关的功能和介导的通路，从而进一步阐明其药理作用及分子机制，为现代中药的研究和开发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 差异基因表达分析 从GEO数据库基因表达数据集(GSE5406)中提取108例ICM病人与16名正常人心肌的基因表达量并进行差异分析。采用Wilcox检验和Limma包进行数据注释，log∣FC∣>0.5，P<0.05作为筛选标准。利用R软件包“pheatmap”进行双向层次聚类分析并绘制热图。所有数据分析采用R软件(版本3.6.2)和草莓版Perl(5.30.1.1)软件。

1.2 筛选参附苓桂术甘汤加减方中药物的活性成分与靶点 通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)以参附苓桂术甘汤加减方中8味中药(红参、炮附子、黄芪、茯苓、桂枝、白术、泽泻、车前子)为关键词检索其化学成分。口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug- likeness，DL)≥0.18为指标筛选各药中活性成分[12]，同时下载有效成分的人源靶点信息。

1.3 构建中药化合物调控网络和蛋白互作(protein-protein interactive，PPI)网络 利用Cytoscape软件(3.7.2版)构建中药活性成分和靶点基因之间的调控网络。通过Bisogenet 插件(3.0.0版)构建PPI网络。然后使用CytoNCA 插件(2.1.6版)对这些节点的拓扑评分进行综合计算、评估和可视化分析，度值(degree centrality，DC)和中心度值(betweenness centrality，BC)，“Without weight”为筛选参数。DC的最小筛选值为61，BC为600。

1.4 靶点基因功能注释与通路分析 为了探究靶点基因的功能与信号转导途径，采用R软件进行靶基因的功能注释和通路分析。功能富集主要通过基因本体(gene ontology，GO)富集分析，分为生物过程(biological processes，BP)、细胞组成(cellular components，CC)或分子功能(molecular functions，MF)3类。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)揭示已鉴定基因的生物信息及信号转导通路。基因数≥2和伪发现率(FDR)<0.05作为测定富集项的显著性阈值。此外，利用Perl脚本和Cytoscape软件构建KEGG的关系网络。

2 结 果

2.1 ICM中差异基因的表达 从GSE5406数据集中共筛选出211个与ICM有关的差异表达基因，其中上调基因88个，下调基因123个，与正常对照组比较差异有统计学意义。前20个上调和下调表达的基因以热图展示(见图1)，所有的差异基因以火山图展示(见图2)。

图1 ICM病人心肌细胞基因表达热图 [红色小正方形代表上调基因(logFC>0.5，P<0.05)；绿色小正方形代表下调基因(-logFC>0.5，P<0.05)]

图2 ICM中差异基因的表达量火山图[红色小圆点代表上调基因(logFC>0.5，P<0.05)；绿色小圆点代表下调基因(-logFC>0.5，P<0.05)]

2.2 参附苓桂术甘汤加减方中生物活性成分的筛选 通过TCMSP共检索到8味中药的化合物，共有636种成分，在这些成分中，324个(50.9%)成分的OB≥30%，其中，93个(28.7%)成分OB≥30%并且DL≥0.18。所有成分详见表1。

表1 参附苓桂术甘汤加减方中8味中药OB≥30%、DL≥0.18的成分数目 单位：种(%)

2.3 中药活性成分和药物靶点基因的调控网络 探索中医药的分子机制是中医药走向现代化的关键，明确中医药治疗疾病的靶点基因是重中之重。在本研究中，构建了参附苓桂术甘汤治疗ICM的活性成分-靶基因之间的复方调控网络(见图3)，该网络由31个节点组成(外周20个节点是中药生物活性成分，中间11个节点是潜在靶点基因)。这些靶点基因包括HSP90AA1、CDKN1A、POR、MYC、GJA1、SERPINE1、CCL2、COL1A1、COL3A1、PCOLCE、ADH1B，他们与20种生物活性成分密切相关。除了MOL000358、MOL000296和MOL000098分别来源于两种中药外，其余17种生物活性成分均来自单一中药，详见表2。红参、附子、茯苓、桂枝、黄芪、车前子6味中药在参附苓桂术甘汤加减方治疗ICM的治疗过程中发挥着重要作用。尤其是黄芪，是该组方中的最关键药物，20个生物活性成分中11个来源于黄芪。

图3 中药复方靶点的调控网络图[椭圆形表示从草药中提取的活性化合物，黄芪(黄色)、车前子(淡绿色)、桂枝(紫色)、附子(黄褐色)和多种中药(红色)；蓝色三角形节点表示靶点基因。连线表示活性成分和靶点基因之间的相互作用]

2.4 PPI网络 通过Bisogenet插件构建了11个靶点基因与其相关联基因的PPI网络。该网络图中共包括1 648个基因。由CytoNCA插件筛选出核心基因，DC最小值为61，共筛选出有269个基因(见图4A)。在此基础上，通过BC最小值600共筛选出19个核心基因(见图4B)。其中包括HSP90AA1和MYC两个靶点基因，核心网络中的这些基因可能是ICM发病的关键基因，特别是高度值基因，如HSP90AA1(degree=811)、MYC(degree=595)、HSP90AB1(degree=573)和NTRK1(degree=519)。

活性成分编码 分子名称OB(%)DL所属中药MOL001735dinatin(洋毛地黄次黄酮)30.970.27车前子MOL007819hypolaetin33.240.28车前子MOL007813dihydrotricetin58.120.28车前子MOL002388delphin_qt(飞燕草甙)57.760.28附子MOL000073ent-epicatechin(表儿茶素)48.960.24桂枝 MOL000492(+)-catechin(儿茶素)54.830.24桂枝MOL004576taxifolin(花旗松素,紫杉叶素)57.840.27桂枝MOL001736(-)-taxifolin(花旗松素,紫杉叶素)60.510.27桂枝MOL000380(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol64.260.42黄芪MOL000417calycosin(毛蕊异黄酮)44.750.24黄芪MOL000239jaranol50.830.29黄芪MOL000392formononetin(芒柄花黄素)69.670.21黄芪MOL0004421,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene39.050.48黄芪MOL000354isorhamnetin(异鼠李素)49.600.31黄芪MOL000387bifendate(联苯双酯)31.100.67黄芪MOL0003787-O-methylisomucronulatol74.690.30黄芪MOL000422kaempferol(山奈酚,莰非醇)41.880.24黄芪MOL000358beta-sitosterol(β-谷甾醇)36.910.75红参,桂枝MOL000296hederagenin(常春藤皂甙元)36.910.75黄芪,茯苓MOL000098quercetin(槲皮素,五羟黄酮)46.430.28黄芪,车前子

图4 Bisogenet 和CytoNCA插件筛选核心基因的过程[A为从1 648个基因中筛选出269个基因(DCmin值=61)的过程；B为从269个基因中筛选出19个基因(BCmin值=600)的过程。黄色节点代表选定的基因；粉色节点代表靶点基因；蓝色节点代表邻居基因]

2.5 GO功能注释和KEGG通路分析 为了详细了解上述靶点基因的生物学特性，利用R软件对11个靶点基因进行了GO功能注释和KEGG富集分析。GO功能注释结果显示，包含176个BP条目、7个条目涉及CC和8个MF条目，基因数目≥2和FDR<0.05作为筛选值。主要涉及DNA合成过程的调控、DNA生物合成的过程、含胶原的细胞外基质、细胞外基质、蛋白酶结合等与心肌纤维化相关的生物作用。主要富集的基因包括HSP90AA1、CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1。GO功能注释详见图5～图7。

图5 参附苓桂术甘汤作用靶点的GO富集分析BP图

图6 参附苓桂术甘汤作用靶点的GO富集分析CC图

图7 参附苓桂术甘汤作用靶点的GO富集分析MF图

KEGG富集分析结果显示，上述靶点基因主要参与5条通路的调控过程。在这些信号通路中，PI3K-Akt信号通路(hsa04151)是最重要的通路，其基因丰度最高，共有4个基因参与该通路调控过程(HSP90AA1、CDKN1A、MYC和COL1A1，见图8)。同时，参与这些通路调控的关键基因(CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1、和HSP90AA1)中CDKN1A基因(参与了全部5条通路的调控)和MYC基因(参与3条信号通路的调控)尤为重要。因此，可以推测他们在ICM的发展中起着关键作用，同时也是参附苓桂术甘汤加减方治疗ICM过程中的关键靶点基因(见图9)。通过药物靶点预测、GO注释和KEGG通路富集分析，推测参附苓桂术甘汤加减方对ICM的作用可能与其关键靶点CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1和HSP90AA1在调节心肌细胞功能中的作用有关。

图8 KEGG通路富集分析图

图9 靶基因和通路之间的调控网络(红色倒三角形节点表示信号通路，棕黄色节点表示靶基因。连线代表了他们之间的相互作用，节点的大小与他们参与调控信号通路的基因数目或基因参与调控的信号通路数成正比)

3 讨 论

ICM以慢性心力衰竭为主要临床表现，中医证候特征为本虚标实、虚实夹杂[13]。中医学将心力衰竭归于“喘证”“心悸”“水肿”等范畴，其发病机制为心气不足、心肾阳虚引起痰瘀水泛，在中医临床治疗上应着重关注益气温阳、活血利水[14]。参附汤和苓桂术甘汤均为中医益气温阳的经典方，组方中红参补元气，制附子温阳，两者合用发挥益心气、温心阳的功效；黄芪补气升阳、利水消肿，茯苓、白术健脾益气利水；桂枝温阳化软，白术祛湿并健脾益气；泽泻、车前子等有利水消肿之效。诸药合用共奏益气温阳、活血利水的功效[10-11]。

本研究通过构建中药活性成分和靶点之间的调控网络，从分子层面阐明参附汤和苓桂术甘汤治疗ICM的作用机制。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，可以持续降低心肌梗死病人血清胆固醇和β-脂蛋白脂质水平[15]。刘佳慰等[16]发现常春藤皂甙元具有一定的降脂效果。槲皮素可以有效缓解自身免疫性心肌炎[17-18]。毛蕊异黄酮、芒柄花黄素等黄芪生物活性成分可以提高缺氧状态下心肌细胞存活率、三磷酸腺苷(ATP)含量，同时影响过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)通路相关蛋白的表达[19-20]；芒柄花黄素可以抑制动脉粥样硬化性单核细胞黏附和炎症反应[21]。异鼠李素通过上调沉默信息调节因子1(SIRT1)和核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)介导的抗氧化信号通路，对心肌细胞损伤具有保护作用[22]。此外，山奈酚可通过抑制炎症反应和氧化应激减轻心脏损伤[23]。儿茶素可以治疗限制性心肌病[24]，同时儿茶素没食子酸酯对高糖诱导的心肌细胞损伤具有保护作用[25]。红豆杉中分离的植物黄酮紫杉叶素可以减轻心肌肥厚，改善心功能，调节氧化应激和减弱凋亡途径[26]。Dihydrotricetin的心脏保护作用可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路防止体内和体外缺血再灌注诱导的细胞凋亡[27]。结合文献及本研究结果，说明网络药理学方法在中医药作用机制分析中具有重要作用。同时，本研究中还有一些活性成分的心肌细胞保护作用尚未见报道，值得进一步探究。其次，通过分析调控网络中的11个靶点基因，最终发现靶点基因HSP90AA1、MYC与高度值基因HSP90AB1、NTRK1最为关键。HSP90AA1已被证实与冠心病相关的血管内皮生长因子(VEGF)信号通路相关[28-29]。Birket等[30]发现MYC参与类胰岛素样生长因子-1对心血管祖细胞的调控过程，而且MYC与调节维持收缩力心脏传导基因的表达具有拮抗关系[31]。HSP90AB1已被证实可以防止心肌缺血再灌注损伤和细胞凋亡[32]。另外，HSP90AA1和HSP90AB1参与病理性心脏重塑小鼠主动脉束带模型中的心脏重塑过程[33]。Preston等[34]发现NTRK1与某些心房颤动的潜在性驱动因素相关。

细胞外基质(ECM)重建广泛应用于多种心脏病，能阻碍心脏充盈，常导致心力衰竭[35-36]。PI3K/Akt在调节运动诱发的生理性心肌肥大和心脏保护的过程中起重要作用[37]。动物实验发现，激活PI3K/Akt信号传导途径可减少心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡，促进血管再生并减轻心室重构[38]。有研究表明，高血糖诱导的心肌细胞凋亡通过体内Nkx2.5-Calr-p53途径的激活介导，从而导致心脏功能障碍和高血糖症引起的心肌病[39]。内皮细胞血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与心肌细胞酪氨酸激酶受体2(ErbB)信号通路之间的关系可导致心肌肥大与血管生成，有助于生理性心脏生长[40-41]。研究表明，在成年心脏中，低氧诱导因子-1(HIF-1)可以防止心肌缺氧[42]。先前的动物实验表明，Serpine1可控制心内膜的成熟和增殖以及心肌细胞的增殖[43]。此外，有研究表明，CDKN1A可以在心脏发育过程中调节心肌细胞增殖[44]。由此可见，参附苓桂术甘汤加减方在治疗ICM中的心肌保护作用主要通过活性成分作用于上述基因，参与调控相关信号通路，尤其是PI3K/Akt-p53凋亡途径发挥着重要的作用，进一步研究其药理机制将是今后的研究方向。

综上所述，基于中药网络药理学构建的“中药活性成分-靶点基因-药理”的调控网络，明确了参附苓桂术甘汤加减治疗ICM的药理作用机制。发现一些靶点基因HSP90AA1、MYC、CDKN1A、SERPINE1和COL1A1在此过程中发挥着重要作用，这些基因可能具有诊断和治疗价值。有研究表明，参附苓桂术甘汤加减治疗ICM，主要通过调节PI3K/Akt、p53、ErbB等信号通路来实现。由此可见，中药网络药理学可以作为一种非常有用的工具预测靶点基因，从而深入研究中药治疗疾病的作用机制，为现代中药的研究和开发提供新思路。