Nrf2/HO-1、cAMP/PKA在TGR5减轻高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用机制

李 熠，冯 健

糖尿病是目前威胁人类健康的主要疾病，长期高血糖、有氧代谢降低的环境可引起心肌细胞代谢与钙转运发生紊乱，凋亡增多，从而引起心室重构、充血性心力衰竭，其发生发展机制较复杂，至今仍未清楚[1]。心肌细胞肥大病人在高糖等多种病理性刺激下可引起心肌细胞的表面积增加、细胞蛋白含量上升，促肥厚基因CARK(Cardiac Ankyrin Repeat Kinase)等表达水平升高，目前认为这种改变可能与相关受体异常表达有关[2-3]。G-蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled receptor for bile acids，TGR5或GPBAR1)属于G-蛋白偶联受体(GRCP)家族，其激活后可改善机体脂质、糖代谢紊乱与胰岛素抵抗，减轻氧化应激，防止糖尿病、代谢综合征等[4]。有研究发现，糖调节受损与2型糖尿病(T2DM)病人的血清TGR5水平较糖耐量正常人群下降，且在T2DM病人中男性血清TGR5较女性高，表明TGR5水平与糖代谢紊乱有一定关联，但关于TGR5对心肌细胞损伤的影响研究甚少[5]。自胚胎大鼠心肌获取的H9C2细胞系和原代乳鼠心肌细胞有高度相似性，常用于心血管疾病的基础研究，本研究选择大鼠H9C2心肌细胞进行培养，并分析激活TGR5对高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H9C2心肌细胞1株(武汉博士德微生物公司)，DMEM/F12培养基与多聚赖氨酸(Hyclone公司)，CO2培养箱(Thermo公司)，光学显微镜(Nikon公司)，-80 ℃冰箱(Thermo公司)，细胞培养皿(Costar公司)，低温高速离心机(Thermo公司)，齐墩果酸(Sigma公司)，澳洲胎牛血清(BOVOGEN公司)，葡萄糖(Sigma公司)，棕榈酸(Sigma公司)，Ⅱ型胶原酶(GIBICO公司)，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Sigma公司)，TGR5 shRNA(上海汉恒生物科技有限公司，慢病毒包装)，核因子E2相关因子2(Nrf2)小干扰RNA分子(siRNA)慢病毒(吉凯基因科技有限公司)，血红素加氧酶-1(HO-1)抑制剂锌原卟啉(ZnPP，百灵威有限公司)，SQ22536(美国MCE公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Biosharp公司进口分公司)，活性氧荧光探针(DCFH-DA，Sigma公司)，小鼠横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)及免疫组化试剂盒均购自武汉博士德微生物公司，胰酶、蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均购自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 取生长状态良好且处于对数生长期的H9C2心肌细胞，放置在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，于5%CO2及37 ℃培养箱中进行传代培养，至细胞生长到约80%融合状态时可用于实验。将细胞分为对照组、高糖+高脂组、高糖+高脂+齐墩果酸组(TGR5受体激动剂)、干扰组[高糖+高脂+齐墩果酸+TGR5 shRNA(以TGR5干扰慢病毒包装)]、Nrf2/HO-1组(高糖+高脂+齐墩果酸+Nrf2 siRNA病毒与ZnPP预处理)、环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)组[高糖+高脂+齐墩果酸+SQ22536(cAMP抑制剂)预处理]。对照组单纯采用DMEM培养基(含2%血清、5.5 mmol/L葡萄糖的低糖培养基)培养心肌细胞48 h；高糖+高脂组采用含2%血清、33.0 mmol/L葡萄糖加入到0.15 mmol/L棕榈酸的DMEM培养基，培养心肌细胞48 h；高糖+高脂+齐墩果酸组采用含2%血清、33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕榈酸、齐墩果酸30 μmol/L的DMEM培养基，培养心肌细胞48 h；干扰组先采用TGR5干扰慢病毒包装将细胞感染，后加入33 mmol/L葡萄糖、0.15 mmol/L棕榈酸，培养48 h；Nrf2/HO-1组以Nrf2 siRNA与ZnPP 10μmol/L预处理高糖+高脂+齐墩果酸(病毒感染处理48 h，方法同TGR5干扰慢病毒，ZnPP处理1 h)；cAMP/PKA组以SQ22536 100 μmol/L预处理高糖+高脂+齐墩果酸3 h。

1.2.2 心肌细胞形态变化过程 采用小鼠α-actinin抗体经免疫荧光法鉴定心肌细胞，在荧光显微镜下对心肌细胞的形态进行观察。依次进行细胞爬片、细胞固定、透膜、封闭、抗体孵育、核染色(DAPI染液)、封片、拍照，带绿色荧光为α-actinin(即为心肌细胞)，蓝色为通过DAPI染色后的细胞核。

1.2.3 MTT法测定心肌细胞活性 于避光环境中向各待测孔中加20 μL的MTT工作液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中反应4 h，后将反应液弃去，各孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪低速震荡10 min，选择检测波长为490 nm，测定此处荧光强度(OD)值，计算细胞活性率。

1.2.4 DCFH-DA测定心肌细胞内活性氧(ROS)水平 心肌细胞以5×105/mL密度接种于6孔板，每孔2 mL，心肌细胞贴壁培养72 h后可进行实验。去除6孔板的检测孔中心肌细胞培养液，加DCFH-DA(10 μmol/L)探针1 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱内进行孵育，20 min后以磷酸缓冲盐溶液(PBS)泡洗3次，每次1 min。胰蛋白酶消化各孔心肌细胞，采用PBS对细胞轻柔吹洗，重复洗涤3次后进行离心以收集细胞，采用流式细胞仪检测各组细胞DCFH-DA荧光强度。操作时严格依据试剂盒说明书进行。

1.2.5 应用图像分析法测定各组心肌细胞表面积 将心肌细胞种在含载玻片的96孔板，采用冷D-Hanks液漂洗，以4%多聚甲醛进行固定，15 min后开始心肌细胞免疫荧光检测并摄像，应用Image tool 3.0软件对单个细胞的表面积进行测量，每张玻片测定5个视野，对从每个视野选取的10～15 个细胞进行测定，每组重复3次，取其平均值进行分析。

1.2.6 采用BCA法测定蛋白含量 收集6孔板中的各组细胞，制成细胞悬液，对每孔的心肌细胞数进行计数，沉淀细胞后加2～3倍体积细胞裂解液，促进心肌细胞膜溶解，在离心后吸取上清并采用BCA法对心肌细胞的蛋白含量进行检测。

1.2.7 Nrf2、HO-1、PKA检测 采用蛋白免疫印迹法(Westren Blot)检测各组Nrf2、HO-1、PKA水平。按试剂盒的说明书进行心肌细胞核总蛋白提取。取一定量的蛋白样品，加缓冲液后震荡混匀，随后在沸水中煮沸5 min使之变性，储存于-20 ℃冰箱中备用或现用。将玻璃板清洗后晾干，分别制备分离胶(10%)和浓缩胶(5%)，在过夜后使用。取样本50 μg加入样本孔，样本两侧均加4 μL的蛋白Marker，初始采用60 V电压电泳，加样本至分离胶时电压增加到110 V，直至样本达分离胶底部，结束电泳。后进行聚偏二氟乙烯(PVDF)转膜，按海绵-转膜滤纸-凝胶-PVDF膜-转膜滤纸-海绵顺序放置转膜夹板，将转膜夹板放至转膜槽(黑对黑)，加入1×转膜缓冲液。电流400 mA，冰冷条件下转膜60 min，后进行封闭、一抗与二抗孵育，显色，经凝胶图像系统对图像进行采集，利用Quantity One软件对结果进行分析。

1.2.8 心肌损伤标志物测定 采用比色法测定肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平，高效液相色谱法(HPLC)测定cAMP。

2 结 果

2.1 荧光显微镜心肌细胞变化 荧光显微镜下显示，对照组心肌细胞核大，被染成淡蓝色，内部有深蓝色颗粒，高糖+高脂组心肌细胞染色强度较对照组增加，大部分细胞核固缩甚至破裂，被染成强蓝色，而高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组大部分心肌细胞恢复正常，仅少许细胞被染成强蓝色，干扰组染色强度较高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组增加。高糖+高脂组染色强度高于对照组，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组染色强度则高于高糖+高脂组，而干扰组染色强度高于高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组。详见图1。

图1 荧光显微镜下各组心肌细胞变化 (A为对照组；B为高糖+高脂组；C为高糖+高脂+齐墩果酸组；D为干扰组；E为Nrf2/HO-1组；F为cAMP/PKA组)

2.2 6组心肌细胞活性、ROS、细胞表面积、蛋白含量比较 6组心肌细胞活性、ROS、细胞表面积、蛋白含量比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，高糖+高脂组心肌细胞活性率下降，ROS水平、心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量增加；高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组心肌细胞活性率高于高糖+高脂组(P<0.01)，ROS水平、心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量低于高糖+高脂组(P<0.01)，与高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组比较，干扰组心肌细胞活性率下降(P<0.01)，ROS水平、心肌细胞表面积及心肌细胞蛋白含量增加(P<0.01)，高糖+高脂组与干扰组心肌细胞活性率、ROS、细胞表面积、蛋白含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组心肌细胞活性率、ROS、细胞表面积、蛋白含量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图2～图5。

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图2 6组心肌细胞活性率比较

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图3 6组ROS水平比较

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图4 6组细胞表面积比较

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图5 6组蛋白含量比较

2.3 6组Nrf2、HO-1、PKA水平比较 6组Nrf2、HO-1、PKA水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+高脂组Nrf2、HO-1、PKA水平高于对照组，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组Nrf2、HO-1、PKA水平均低于高糖+高脂组，干扰组Nrf2、HO-1、PKA水平均高于高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组，差异均有统计学意义(P<0.01)；高糖+高脂组与干扰组Nrf2、HO-1、PKA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组Nrf2、HO-1、PKA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图6～图8及表1。

图6 Western Blot法检测Nrf2水平(1为对照组；2为高糖+高脂组；3为高糖+高脂+齐墩果酸组；4为干扰组；5为Nrf2/HO-1组；6为cAMP/PKA组)

图7 Western Blot法检测HO-1水平 (1为对照组；2为高糖+高脂组；3为高糖+高脂+齐墩果酸组；4为干扰组；5为Nrf2/HO-1组；6为cAMP/PKA组)

图8 Western Blot法检测PKA水平(1为对照组；2为高糖+高脂组；3为高糖+高脂+齐墩果酸组；4为干扰组；5为Nrf2/HO-1组；6为cAMP/PKA组)

表1 6组Nrf2、HO-1、PKA水平比较(±s)

2.4 6组CK、LDH、cAMP水平比较 6组CK、LDH、cAMP水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+高脂组、高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组、干扰组CK、LDH、cAMP水平高于对照组，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组CK、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂组，干扰组CK、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组，差异均有统计学意义(P<0.01)；高糖+高脂组与干扰组CK、LDH、cAMP水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组CK、LDH、cAMP水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图9～图11。

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图9 6组CK水平比较

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图10 6组LDH水平比较

与对照组比较，＊P<0.01；与高糖+高脂组比较，#P<0.01；与高糖+高脂+齐墩果酸组比较，△P<0.01；与Nrf2/HO-1组比较，☆P<0.01；与cAMP/PKA组比较，▲P<0.01。图11 6组cAMP水平比较

3 讨 论

糖尿病为胰岛β细胞功能受损、导致胰岛素缺乏或相对缺乏而导致的疾病，随着人们生活与饮食习惯改变，该病发生率呈逐年升高趋势，且发病有逐渐年轻化趋势[6]。糖尿病相关的心血管并发症是其主要死因，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)最终可发展为有症状的心力衰竭，因而明确糖尿病与心肌细胞损伤的关系有重要意义[7-8]。TGR5是一种新型G蛋白耦联胆汁酸受体，可于激活状态下经cAMP引导信号通路传递生物调节信号，激活下游转录因子，并调控下游基因的表达，与糖代谢及脂代谢有密切关联[9]，研究发现，TGR5在胆管癌细胞(RBE)中呈高表达，可能与胆管癌的进展密切相关[10]，而激活的TGR5受体是否可经过cAMP活化而对糖尿病发挥抗氧化应激作用目前未见报道。

高糖、高脂诱发的氧化应激损伤为糖尿病心肌病重要发病机制，这可能与高糖、高脂在体内发生氧化导致ROS蓄积有关，因此，高糖、高脂可持续而稳定地产生ROS，从而有效地模拟糖尿病时细胞所处氧化环境。大鼠心肌细胞H9C2有可传代、易培养、实验稳定等特点，常用于心血管疾病的基础研究。本研究采用高糖、高脂在体外诱导H9C2细胞产生氧化应激损伤，成功地建立氧化应激损伤模型。经荧光显微镜显示，高糖+高脂组心肌细胞染色强度较对照组增加，而高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组大部分心肌细胞恢复正常，仅少许细胞被染成强蓝色，干扰组染色强度较高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组增加，同时MTT法检测也发现高糖+高脂+齐墩果酸组心肌细胞存活率高于高糖+高脂组，而干扰组心肌细胞存活率低于高糖+高脂+齐墩果酸组，这表明齐墩果酸可能经激活H9C2心肌细胞TGR5受体明显减轻心肌细胞凋亡。既往也有研究表明，齐墩果酸可增加肝糖原的含量并使血清胰岛素水平升高而降低血糖[11]。心肌对葡萄糖的利用减少及对脂肪酸摄取不平衡，能量的存储发生改变，而由细胞器产生的氧化代谢增多，均可促使ROS产生增加，超出机体一定清除能力，无法及时清除ROS，继而导致氧化应激引起的生理性变化，最终ROS直接损伤细胞DNA，诱导心肌细胞凋亡。本研究中高糖+高脂组ROS水平及心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量高于对照组，而高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组心肌细胞活性率则高于高糖+高脂组，心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量低于高糖+高脂组，在予以TGR5 siRNA干扰后，干扰组心肌细胞活性率下降，ROS水平及心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量增加，这与早期有关学者的报道结果[12]相近，表明齐墩果酸激活TGR5后可使心肌细胞中ROS含量明显降低，从而减少心肌细胞氧化应激损伤，避免高糖、高脂对H9C2心肌细胞的损伤，减少糖尿病对心脏造成的损害，这可能是糖尿病心肌病病人重要的药物治疗靶点。TGR5激活可通过抑制炎症反应，减轻胰岛素抵抗及高脂反应而缓解代谢炎症[13]。Brighton等[14]研究发现，胆汁酸可将肠道内的分泌L细胞的多种信号通路激活，但胰升糖素样肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)分泌主要取决于TGR5是否活化，功能性TGR大部分分布在L细胞的后基底部，胆汁酸或TGR5激动剂可促进胰岛素分泌需要通过肠道内皮的吸收过程。Molepo等[15]也发现，齐墩果酸对脂质代谢和葡萄糖转运有一定影响；Li等[16]研究结果也提示TGR5可以减轻缺血再灌注诱导的线粒体功能障碍、细胞凋亡和炎症反应，这些保护作用可能是通过蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3(protein kinase B/glycogen synthase kinase-3，AKT/GSK-3β)途径实现的。因此，TGR5的激活对H9C2心肌细胞有保护作用，当然本研究也局限于体外细胞试验，关于本研究结论有待后期进一步在体内动物实验中进行验证。

Ding等[17]的研究指出，TGR5受体可介导饮食诱导的肥胖小鼠在接受垂直袖状胃切除术(vertical sleeve gastrectomy，VSG)后相应有益代谢作用消失，TGR5水平增加能明显改善胆汁酸的水平及其组成，促使回肠及棕色脂肪组织中的TGR5信号增强，以较好地改善血糖和增加能耗。有研究发现，TGR5激活减轻高血糖诱导的H9C2细胞心肌肥厚，可经刺激PKA增强而使受磷蛋白(phospho-lamban，PLN)磷酸化，从而激活SERCA2a将钙从胞浆中移至肌浆网，并使钙调神经磷酸酶与NFAT信号通路降低，从而减轻高血糖所致的心肌细胞肥大[18]。Kumar等[19]认为，TGR可通过参与能量稳态的调节而抑制炎症反应。这些研究均表明TGR5与糖尿病代谢密切相关。本研究中，高糖+高脂组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平高于对照组，高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂组，干扰组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组，提示激活TGR5对高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤有保护作用，其信号转导机制可能与Nrf2/HO-1及cAMP/PKA信号通路有密切关联。在正常人体中，TGR5可表达于机体多种组织与细胞，生理状态下TGR5作为跨膜蛋白其一端位于膜外感受器激动剂，另一端则位于胞浆中，可结合相应分子通过cAMP介导的信号途径进行信号传递，启动下游的转录因子[20]。TGR5激活后能较好控制血糖，调节血脂水平，从而使能量消耗提高并起到抗炎作用，有望成为较多代谢性疾病的药物治疗靶点[21]。一般而言，TGR5受体激活后，腺苷酸环化酶活性增强，引起cAMP水平升高，cAMP依赖的PKA磷酸化水平随之升高，而PKA可导致AKT激活，促进GSK-3β磷酸化而引起GSK-3β失活[22-23]，因而推测TGR5受体激活后导致PKA激活，继而促进AKT与GSK-3β磷酸化，引起Nrf2、Keapl解偶联并转位在细胞核中，同抗氧化反应元件结合，促进启动子区域(AREs)调控的抗氧化酶基因转录与表达，如HO-1，继而参与改善糖诱导的细胞功能紊乱，文星[24]的研究结果也表明，激活TGR5可明显减轻G/GO模型诱导的心肌细胞氧化应激损伤，Nrf2/HO-1信号通路则可能参与TGR5减轻心肌细胞氧化应激损伤的过程。本研究可为心肌损伤的药物治疗靶点研究及药物开发提供依据。

本研究结果表明，激活TGR5受体对高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞有保护作用，其作用机制可能与Nrf2/HO-1、cAMP/PKA信号通路密切相关，有望成为改善糖尿病病人心肌损伤的药物治疗靶点。