基于层次分析法结合Box-Behnken响应面法优选陈皮麻黄饮水提工艺*

谭娥玉，王贤儿，林信亨，马少锋，关琴笑，唐兴荣

（江门市五邑中医院，广东 江门 529000）

陈皮麻黄饮是名中医唐兴荣在临床上实践多年的验方，该方由二陈汤和三子养亲汤加减化裁而成，由陈皮、苦杏仁、紫苏子、桔梗、麻黄、干姜、甘草、五味子、金荞麦9味中药组成，具有温肺化饮、止咳平喘的功效，主要用于日久不愈的咳嗽诸证，现拟将其制备为合剂。为确保制剂质量的稳定性及有效性，本实验以苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸及总黄酮含量为综合评价指标，采用层次分析法（AHP）确定各指标权重系数，结合Box-Behnken响应面法优选陈皮麻黄饮的水提工艺，为进一步完善该制剂的制备工艺提供可靠依据。

1 仪器与材料

1.1 材料陈皮、苦杏仁、紫苏子、桔梗、麻黄、干姜、甘草、五味子、金荞麦饮片均购自广州市集芝宝中药有限公司，经我院药学部李燕晖副主任中药师鉴定为正品；橙皮苷对照品（批号：MUST-19030701，纯度：98.46%）、苦杏仁苷对照品（批号：MUST-19042820，纯度：99.28%）、迷迭香酸对照品（批号：MUST-19053107，纯度：99.02%）、甘草酸单铵盐对照品（批号：MUST-16113011，纯度：99.10%）（成都曼思特生物科技有限公司）；磷酸为分析纯，水为超纯水，甲醇为色谱纯。

1.2 仪器1260 InfinityⅡ型HPLC仪[美国Agilent公司，包括四元泵（G7111A）、自动进样器（G7129A）、柱温箱（G7129A）、DAD检测器（G7117C）、色谱工作站（OpenLAB CDS Chem－Station）]；WH-800型超声波清洗机（济宁万和超声电子设备有限公司）；HH-3A型数显恒温三温水浴锅（金坛市精达仪器制造有限公司）；XS205DU型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；T6型紫外可见光-分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；Best-S30型超纯水机（芷昂仪器上海有限公司）。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法同时测定陈皮麻黄饮中苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脱：0.00～5.00 min，10%A，5.01～6.00 min，10%～18%A，6.01～16.00 min，18%A，16.01～17.00 min，18%～20%A，17.01～32.00 min，20%A，32.01～33.00 min，20%～50%A，33.01～45.00 min，50%A，45.01～50.00 min，10%A。检测波长：苦杏仁苷207nm，0～16min；橙皮苷283 nm，16～25 min；迷迭香酸330 nm，25～30 min；甘草酸250nm，35～50min。流速：1.0mL/min；柱温：35℃，进样量：5 μL。

2.1.2 对照品溶液配制

2.1.2.1 对照品贮备液配制 精密称取苦杏仁苷16.55 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.31 mg苦杏仁苷的贮备液；精密称取橙皮苷16.40 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.28 mg橙皮苷的贮备液；精密称取迷迭香酸4.41 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.441 mg迷迭香酸的贮备液；精密称取甘草酸单铵盐9.34 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1.868 mg甘草酸单铵盐的贮备液。

2.1.2.2 混合对照品溶液配制 分别精密量取苦杏仁苷贮备液4 mL、橙皮苷贮备液2 mL、迷迭香酸贮备液1 mL、甘草酸单铵盐贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含苦杏仁苷1.324 0 mg、橙皮苷0.656 0 mg、迷迭香酸0.044 1 mg、甘草酸单铵盐0.186 8 mg的混合对照品溶液。（甘草酸质量=甘草酸单铵盐质量/1.020 7）

2.1.3 供试品溶液配制 精密量取陈皮麻黄饮水提液20 mL，水浴蒸干，加甲醇20 mL超声30 min，转移至20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 阴性对照品溶液配制 取缺少苦杏仁、陈皮、紫苏子、甘草的阴性对照样品，按上述供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.1.5 系统适应性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，见图1。由图1可知，供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应位置上有相同的色谱峰，且阴性对照对测定无干扰，说明该方法可行。

图1 HPLC色谱图

2.1.6 线性关系考察 将混合对照溶液稀释为系列对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，进行线性回归计算，即得苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单铵盐的回归方程、相关系数及线性范围。结果表明4种指标成分在各自含量范围内线性关系良好。（见表1）

表1 线性关系考察结果

2.1.7 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定5次，以峰面积指标计算RSD（n=5）。结果显示苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单铵盐峰面积的RSD分别为0.92%、1.02%、1.03%、0.97%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单胺盐峰面积RSD，RSD分别为1.02%、1.05%、1.23%、2.69%（n=5），表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 取同一水提液适量，按“2.1.3”平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，同时测定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单铵盐的峰面积，计算其峰面积RSD，RSD分别为0.94%、0.45%、0.67%、2.16%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液10 mL，共6份，分别置于20 mL量瓶中，分别精密加入各对照品溶液，加水定容至刻度，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单铵盐峰面积，由回归方程计算，计算平均加样回收率和RSD。苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸单铵盐平均加样回收率分别为95.32%、96.64%、96.09%、95.87%，其RSD分别为4.63%、3.05%、4.89%、2.80%，均小于5%。

2.2 紫外-分光光度法（UV）测定陈皮麻黄饮中总黄酮的含量

2.2.1 供试品溶液的制备 取20 mL浓缩水提液置于蒸发皿中，水浴蒸干后加入20 mL甲醇，超声30 min，置于20 mL容量瓶中，定容，得甲醇提取液。精密吸取甲醇提取液1 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的配制 准确称量橙皮苷对照品7.03 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，摇匀，即得0.351 5 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 显色剂的配制 称取ZrOCl2·8H2O固体2 g置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配成2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液。

2.2.4 测定方法及波长的选择 参考相关文献[1-2]，准确吸取供试品溶液、对照品溶液各1 mL，置于20 mL容量瓶中，分别加入1 mL 2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液进行显色，再加入甲醇定容至刻度，摇匀。用2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液作为空白对照，放置15 min后，用紫外-可见分光光度计在200～600 nm波长处进行全波段扫描，结果显色的供试品溶液、对照品溶液在313 nm波长处有最大吸收，故选择总黄酮的测定波长为313 nm。

图2 全波段扫描光谱图

2.2.5 线性关系考察 取0.351 5 mg/mL对照品溶液0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL分别置于20 mL容量瓶中，加入1 mL 2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀。在313 nm波长处进行检测，结果在0.021 09～0.049 21 mg/mL范围内具良好线性，回归方程y=15.092x+0.011 1，R2=0.999 6。

2.3 层次分析法（AHP）确定各考察指标的权重系数 参考相关文献[3-5]，根据本方的配伍特点、各药材的实际配比及药理作用强弱，采用AHP法将橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、总黄酮含量这5个指标的重要程度予以量化，确定各指标优先顺序：橙皮苷＞苦杏仁苷=迷迭香酸＞甘草酸＞总黄酮，具体判断矩阵见表2。采用几何平均法计算得橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、总黄酮含量权重系数分别为0.449 8、0.193 7、0.193 7、0.105 0、0.057 7，随机一致性比率（CR）＜0.1，说明指标优先比较判断矩阵满足一致性要求，权重系数有效、可行。

表2 各指标5个层次的优先矩阵

2.4 Box-Behnken响应面法优化水提工艺

2.4.1 水提工艺 称取处方量1/10药材，置于500 mL具塞三角烧瓶，加适量纯水，浸渍30 min后，加热煮沸，调至慢火，静置，抽滤，滤液浓缩至100 mL。

2.4.2 响应面设计及结果 本制剂是以原药材饮片进行投料煎煮的传统剂型，方中含有较多根茎类及种子类坚实药材，水提过程中扩散较慢，为利于成分充分浸出，参考相关文献[6-9]，并根据前期单因素实验结果，以溶媒用量、提取次数和提取时间为影响因素，确定优化范围，以5个指标含量作为水提工艺的考察指标，设计3因素3水平Box-Behnken响应面实验（见表3），按照实验安排表（见表4）平行称取17份药材按照“2.4.1”项下方法进行实验，按照“2.1.1”项下方法测定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸含量，按照“2.2.4”项下方法测定总黄酮含量，结合归一化法和权重系数计算总分，总分=（苦杏仁苷含量×0.193 7/最大苦杏仁苷含量+橙皮苷含量×0.449 8/最大橙皮苷含量+迷迭香酸含量×0.193 7/最大迷迭香酸含量+甘草酸含量×0.1050/最大甘草酸含量+总黄酮含量×0.057 7/最大总黄酮含量）×100，结果见表4。

表3 Box-Behnken实验设计因素水平表

表4 响应面实验安排及结果

2.4.3 实验结果分析 利用方差分析对各因素进行多元二次回归，得到的回归方程Y=64.70+6.00A+13.99B+2.92C+4.42 AB+5.84A2+7.67B2，响应面结果的方差分析见表5，结果显示，水提工艺考察的3个因素中，溶媒用量（A）为显著项，提取次数（B）为极显著项，提取时间（C）为不显著项；二次项中，B2为显著项，表明考察因素与响应面值之间并非简单的线性关系。模型整体具有极显著性（P=0.000 6），且失拟合程度不显著（P=0.705 3），表明模型能较好地反映溶媒用量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）与评价指标加权得分（Y）之间的变化关系，能够预测和分析该水提工艺。按照所得模型绘制的溶媒用量、提取次数、提取时间的交互作用对陈皮麻黄饮的水提工艺影响的3D响应面图和等高线图见图3，从图3中可以看出，考察的3个对象3者交互作用不明显。软件Design Expert 12得出陈皮麻黄饮的水提工艺为溶媒用量12倍，提取次数3次，每次提取时间1 h。

图3 溶媒用量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）交互作用的三维响应面图

表5 综合得分回归模型方差分析表

2.4.4 验证实验 按照优选工艺，进行3次平行验证实验，结果见表6，综合评分说明优选的提取工艺合理可行。苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸、总黄酮平均含量分别为1.060 7、0.454 6、0.034 7、0.105 6、8.203 6 mg/mL，RSD分别为4.05%、4.70%、1.36%、2.65%、1.18%，预测综合得分102.61，实际综合得分（101.28±3.10），RSD为3.06%，与预测值差异较小，且在合理范围内，表明提取工艺结果稳定，预测结果可信。

表6 验证实验结果

3 讨 论

陈皮麻黄饮的组方为9种常见的中药，处方来源为二陈汤和三子养亲汤加减化裁而成。本研究根据其组方配伍特点，选择制剂中有效成分和组分作为评价指标进行研究。方中陈皮为君药，研究表明橙皮苷为陈皮的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、调节免疫力等药理作用[10]；苦杏仁中的苦杏仁苷具有止咳、平喘、抗肺纤维化等药理作用[11]；迷迭香酸为紫苏子主要的酚酸类活性成分[12]；甘草酸为甘草中主要活性成分之一[13-14]；黄酮类化合物是植物中重要的次生代谢产物，在抗病毒、抗炎、降血脂、降血糖、抑菌和抗癌等方面发挥着重要的作用[15]。从有效成分充分提取的角度考虑，结合该方的君、臣、佐、使配伍关系，将橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸及总黄酮的含量作为考察指标，采用AHP法对指标赋权并结合归一化法计算各组实验总分，同时也兼顾处方的配伍特点及药效物质基础，既能有效保障提取的全面性，又符合中医整体论治的指导原则[16]。

中药复方提取液中黄酮类物质种类繁多，理化性质也存在差异，而UV法的专一性较差，本课题组在预实验中采用直接UV法测定总黄酮含量，由于存在较强的背景吸收而导致测定值偏高。陈皮麻黄饮中以陈皮为君药，其主要的有效成分为橙皮苷，属于二氢黄酮类化合物，在硝酸铝显色体系中不能产生特征吸收峰，因此，本实验最终采用ZrOCl2比色法，利用水提液中的黄酮类成分与ZrOCl2络合反应后，在313 nm波长处吸光度值发生显著变化，所测得的吸光度值与水提液中的黄酮类组分在0.021 09～0.049 21 mg/mL范围内具良好线性关系，而水提液中的其他组分在该波长下无吸收，因此可较好避免背景吸收的干扰。

本实验采用的Box-Behnken是响应面设计中常用方法，与正交法相比，响应面法优点在于精确度更高、模拟程度更好，更适合于多因素、多水平共同影响的实验，也兼顾了影响因素及各因素间的交互作用，通过二项式能更准确地获取与真实实验接近的最优条件[17]。本次优化的提取工艺简便易行，预测效果好，可以为进一步的制剂研发提供理论依据。