灵芝三萜对鼻咽癌小鼠免疫功能及T细胞亚群分化的影响

王 松，王玲玲，阿依恒·曲库尔汗

（新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830054）

鼻咽癌是发生于鼻咽腔侧壁、顶部的恶性肿瘤，常见表现为鼻塞、耳闷堵感、头痛、听力下降、涕中带血等，对患者健康、生命构成了威胁[1]。目前，鼻咽癌主流疗法为同步放化疗，疗效尚可，但对免疫系统造成了极大破坏，不利于康复、转归[2]。有研究表明[3]，鼻咽癌发病与免疫功能下降有关，因而增强鼻咽癌患者免疫功能是改善预后的途径之一。灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌，为补益类中药，有扶正固本、延年益寿等功效。研究发现[4]，灵芝及其提取物有抗肿瘤、降血脂、增强免疫力等作用。灵芝三萜是灵芝重要组成成分，灵芝的多种药理活性与其相关。故本研究拟观察灵芝三萜对鼻咽癌小鼠模型免疫功能的影响，以期为灵芝三萜用于鼻咽癌免疫治疗提供理论依据。

1 材 料

1.1 实验动物4周龄SPF级Balb/c小鼠65只，雌雄各半，体质量20～25 g，购自南方医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（粤）2016-0015。实验前适应性饲养1周，饲养条件为室温22～26℃，湿度40%～60%，自然光照，自由摄食水。本实验经医学实验动物管理委员会批准，批准号：20190511。

1.2 细胞株人低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞株CNE-2，购自南方医科大学附属第一医院生物研究室。

1.3 药物与试剂灵芝三萜（纯度＞99%，日本第一药品产业株式会社，批号：20181209）；重组人干扰素α1b注射液（北京三元基因药业股份有限公司；批准文号S20040010）。小鼠免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）ELISA检测试剂盒（批号：20190922）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）ELISA检测试剂盒（批号：20190813）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）ELISA检测试剂盒（批号：20190907）均购自武汉华美生物工程有限公司；白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：20190821）；转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：20190719）。

1.4 主要仪器GB204型电子天平（瑞士特勒公司）；SAF-680T酶标仪（上海旦鼎国际贸易有限公司）；Cytomics TM FC500型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

2 方 法

2.1 分组与造模65只Balb/c小鼠留取10只作为对照组，不作任何处理，其余建立鼻咽癌小鼠模型[5]，将小鼠置入24 h光照调节动物饲养箱内饲养3周，取CNE-2鼻咽癌细胞在5%CO2、37℃条件下的RPMI培养基中培养，每隔2 d传代1次，收集对数生长期肿瘤细胞系细胞，胰酶消化，1 500 r/min离心5 min，计数后配制成1.0×107个/mL单细胞悬液。无菌条件下，小鼠右侧背部皮下接种单细胞悬液，10 d后小鼠右侧背部皮下出现可触及绿豆大小的肿瘤块，往后每隔1周测量1次肿瘤直径，接种21 d时肿瘤体积在100 mm3以上表示建模成功。55只小鼠共建模成功44只，随机分为模型组、干扰素组、低剂量组、高剂量组，每组11只。

2.2 实验给药低、高剂量组大鼠分别灌胃给予灵芝三萜溶液，剂量分别为25、50 mg/kg，灌胃体积均为0.2 mL/10 g，1次/d；干扰素组大鼠肌内注射40 000 U/mL重组人干扰素α1b注射液，隔天1次；模型组、对照组大鼠灌胃给予生理盐水，0.2 mL/10 g，1次/d；各组大鼠均干预4周。

2.3 观察指标

2.3.1 肿瘤质量、抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数 干预4周后，观察小鼠精神状态、二便、饮食、毛色、活动情况等方面指标，每周测定1次小鼠背上肿瘤体积变化，并记录数据。末次给药24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，肿瘤剥离后立即浸入10%多聚甲醛溶液中固定，称重后计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数。抑瘤率=（模型组肿瘤质量-治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%；胸腺（脾脏）指数=胸腺（脾脏）质量（mg）/体质量（g）。

2.3.2 血清IgA、IgG、IgM、IL-10、TGF-β 小鼠颈椎脱臼处死前，眼球取血，EDTA抗凝，室温静置0.5 h，3 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液。参考ELISA试剂盒说明书，采用双抗体夹心法检测，配置IgA、IgG、IgM、IL-10、TGF-β标准品，采用标本稀释液按1:2 000比例稀释，取标准品各50 μL依次加入酶标板一排6孔内，其他各孔加入稀释液稀释的小鼠血清50 μL。加入50 μL生物素标记的抗体，加盖后37℃反应1 h。弃液甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/孔，甩干，依序每个孔加入底物溶液90 μL，37℃避光显色20 min，依序加终止液50 μL，终止反应。酶标仪在450 nm波长依序测量各孔光密度值（OD值），加入终止液后15 min内检测，实验3次，取平均值。

2.3.3 小鼠脾脏T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+检测 取小鼠脾脏，剔除结缔组织、脂肪组织，称重后置于尼纶网上，再将尼纶网置入PBS液，轻压脾脏组织，将单个核细胞经网置入PBS液，吸取PBS液置入15 mL离心管内，2 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，弃上清，加入1 mL PBS，震荡混匀，离心后弃上清，加入PBS，调整细胞浓度为107个/mL。取流式管，加入CD3e FITC抗体1 μL、CD4 PE抗体0.625 μL、CD8a PE-Cy5抗体0.625 μL，再加入107个/mL脾细胞悬液100 μL，混匀后加入流式管（已预先加入了流式抗体），混匀后避光孵育15 min，再加入OptiLyseC 500 μL，立刻混匀，剧烈震荡30 s，室温避光孵育15 min，加入1 mL PBS，混匀后1 000 g离心5 min，离心半径10 cm，弃上清，细胞沉淀加入500 μL流式鞘液重悬，上机检测，实验3次，取平均值。对淋巴细胞作FICT、PE、PE-Cy5荧光强度检测，其中FICT为荧光1（FL1），PE为荧光2（FL2），PE-Cy5为复合荧光4（FL4）。

2.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件分析，计量资料以（±s）表示，肿瘤体积、肿瘤质量、抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数、免疫球蛋白水平及脾T淋巴细胞亚群指标水平均经Levene检验提示方差齐，进行单因素方差分析和LSD-t比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠一般状况对照组小鼠毛色、二便、饮食、活动状态均正常，体形无明显改变。55只建模小鼠第10天时，44只小鼠体内出现大小不等的肿瘤结节，成瘤率为80.00%（44/55）。与对照组小鼠比较，模型组小鼠行动迟缓，皮毛蓬松无光泽，饮食下降，肿瘤体积逐渐增大，体质量因瘤体增大而增加；低剂量组、高剂量组和干扰素组小鼠行为、皮毛、饮食情况等均有所改善，肿瘤体积伴随用药时间延长而逐渐减小。（见图1）

图1 各组小鼠给药后肿瘤体积变化比较（±s）

3.2 各组小鼠肿瘤质量与抑瘤率比较与模型组比较，低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠肿瘤质量降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组、干扰素组小鼠肿瘤质量降低（P＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，干扰素组小鼠肿瘤质量降低（P＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较（±s）

表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05；与高剂量组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量 肿瘤质量（g） 抑瘤率（%）模型组 11 - 1.72±0.22 -低剂量组11 25 mg/kg 1.29±0.25a 25.34±1.25高剂量组11 50 mg/kg 0.95±0.14a b 44.77±2.67b干扰素组11 40 000 U/mL 0.77±0.13a b c 55.23±2.75b c F 51.841 467.083 P 0.000 0.000

3.3 各组小鼠胸腺指数与脾脏指数比较与对照组比较，模型组、低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠胸腺指数和脾脏指数均降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组、干扰素组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，干扰素组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠胸腺指数与脾脏指数比较（±s，mg/g）

表2 各组小鼠胸腺指数与脾脏指数比较（±s，mg/g）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 胸腺指数 脾脏指数对照组 10 - 3.31±0.36 6.05±0.32模型组 11 - 2.08±0.15a 3.88±0.25a低剂量组11 25 mg/kg 2.34±0.11a b 4.31±0.24a b高剂量组11 50 mg/kg 2.66±0.23a b c 4.99±0.28a b c干扰素组11 40 000 U/mL 3.01±0.29a b c d 5.51±0.35a b c d F 44.180 96.775 P 0.000 0.000

3.4 各组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比较与对照组比较，模型组、低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组、干扰素组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，干扰素组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比较（±s，μg/mL）

表3 各组小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比较（±s，μg/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 IgA IgG IgM对照组 10 - 54.63±3.21 433.65±10.28 588.34±10.14模型组 11 - 36.31±1.75a 342.26±9.12a 533.15±8.39a低剂量组11 25 mg/kg 40.39±1.69ab 380.47±8.47ab 541.18±7.24ab高剂量组11 50 mg/kg 45.28±1.28abc 401.45±8.26abc 552.63±6.41abc干扰素组11 40 000 U/mL 50.36±0.97abcd 419.85±7.74abcd 570.17±5.17abcd F 158.955 178.508 90.577 P 0.000 0.000 0.000

3.5 各组小鼠血清IL-10、TGF-β水平比较对照组比较，模型组、低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠血清IL-10、TGF-β水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组、干扰素组小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）；与高剂量组比较，干扰素组小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组小鼠血清IL-10、TGF-β水平比较（±s，ng/L）

表4 各组小鼠血清IL-10、TGF-β水平比较（±s，ng/L）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 IL-10 TGF-β对照组 10 - 16.24±0.69 27.56±2.22模型组 11 - 31.35±1.25a 59.67±3.67a低剂量组11 25 mg/kg 29.48±0.55ab 55.31±3.23ab高剂量组11 50 mg/kg 26.18±0.78ab c 40.34±2.28ab c干扰素组11 40 000 U/mL 22.67±1.03ab cd 30.59±2.54ab cd F 490.389 276.071 P 0.000 0.000

3.6 各组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群变化比较与对照组比较，模型组、低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值均降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、干扰素组小鼠脾脏CD3+、CD4+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组、干扰素组小鼠脾脏CD3+、CD4+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，干扰素组小鼠脾脏CD3+、CD4+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）。（见图2、表5）

表5 各组小鼠小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比较（±s）

表5 各组小鼠小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量 CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+对照组 10 - 67.64±3.75 48.36±4.15 23.94±5.25 2.02±0.05模型组 11 - 40.36±3.28a 29.78±2.37a 19.72±4.28a 1.51±0.03a低剂量组11 25 mg/kg 48.14±2.89ab 35.49±3.41ab 20.05±4.44ab 1.77±0.04ab高剂量组11 50 mg/kg 55.97±3.74abc 40.49±2.55abc 22.13±3.51abc 1.83±0.05abc干扰素组11 40 000 U/mL 62.34±2.59abcd 46.34±1.56abcd 24.26±4.52abcd 1.91±0.03abcd F 118.373 73.949 2.473 234.644 P 0.000 0.000 0.057 0.000

图2 各组小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞占比

4 讨 论

鼻咽癌发病隐匿，确诊时多进展至晚期，尽管目前研究已对其早期诊断、治疗等方法进行了深入研究，但迄今仍未取得突破性进展，其防治工作依然是医学界重要研究课题。鼻咽癌发病机制尚不清楚，病因涉及免疫功能下降、EB病毒感染、遗传因素、饮食环境等[6]。鼻咽部解剖复杂，这一点决定了手术危险性，目前以放化疗为主，但存在非特异毒性、放疗耐受、远处转移、免疫低下等弊端[7]。我国传统医学主张以中药治疗鼻咽癌，国外也将中药作为补充替代医学进行过研究[8]。中医学强调“正气存内，邪不可干”，这一独特切入点反映在鼻咽癌治疗中主要表现为调节阴阳平衡，改善免疫功能，以抵抗病邪，可弥补放化疗的不足。

灵芝三萜是灵芝药用功效的主要活性成分，药理活性广泛，有抗肿瘤、增强免疫功能等效应，适宜作为低毒性辅助性药物治疗鼻咽癌。灵芝作为天然植物类药物，抗肿瘤作用早有报道，但灵芝三萜用于鼻咽癌治疗研究的报道鲜见[9]。本研究为了解灵芝三萜抗鼻咽癌活性及作用机制，通过种植CNE-2鼻咽癌细胞建立鼻咽癌小鼠模型。结果表明，与对照组比较，造模小鼠毛色、二便、饮食、活动状态及体质量均有异常改变，经灵芝三萜干预后明显改善；进一步计算肿瘤质量与抑瘤率，从模型组到低剂量组、高剂量组、干扰素组，小鼠肿瘤质量依次下降，高剂量组、干扰素组抑瘤率高于低剂量组，提示灵芝三萜用于鼻咽癌治疗中可抑制肿瘤生长，改善小鼠一般状况，尤以高剂量灵芝三萜为佳，其效果仅次于干扰素。干扰素是一种兼有抗病毒、抗肿瘤作用的免疫增强剂，在肿瘤治疗中可发挥抑制肿瘤、增强免疫功能的双重作用，适宜用于鼻咽癌放化疗时辅助治疗。现代医学认为[10-11]，机体免疫功能与肿瘤产生、发展密切相关，但宿主免疫功能受抑制时，肿瘤发生风险大，且肿瘤增长时免疫功能受抑制，二者互为因果，因此调节机体免疫功能是防治癌症的关键步骤之一。

胸腺是中枢免疫器官，主要参与细胞免疫，负责调节机体免疫功能，可分泌多种细胞因子，促进T细胞成熟，在建立自身免疫耐受、维持免疫自稳方面发挥着不可或缺的作用[12]。脾脏为外周免疫器官，是T淋巴细胞、B淋巴细胞定居及产生免疫应答的场所，淋巴细胞、巨噬细胞丰富，与体液免疫关系密切[13]。胸腺与脾脏的质量与其免疫细胞数量、功能有关，二者脏器指数可反映机体免疫功能[14]。本研究结果显示，从模型组到低剂量组、高剂量组、干扰素组，小鼠胸腺指数和脾脏指数依次升高，提示灵芝三萜可增强鼻咽癌小鼠免疫功能。IgG是人工主动免疫后机体产生的抗体，是个体发挥免疫功能的主力；IgM是体液免疫应答中最早产生的抗体，在早期免疫中发挥重要作用；IgA是外分泌液中主要抗体，与IgG、IgM共为人体重要免疫球蛋白，可结合外界抗原，发挥防御、保护作用[15]。肿瘤已经发展出多种机制逃避免疫监视，产生免疫抑制细胞因子即重要因素之一，TGF-β是目前已知的最强免疫抑制因子。由T细胞生成TGF-β是抑制免疫应答的重要因素。研究发现[16]，抑制肿瘤源性TGF-β可控制肿瘤增长，延长荷瘤小鼠存活率。IL-10是一种多效性细胞因子，具有双向免疫调节作用，可通过抗原提呈细胞发挥免疫抑制作用，在肿瘤环境中对免疫应答可发挥负向调节作用[17]。本研究结果显示，从模型组到低剂量组、高剂量组、干扰素组，小鼠血清IgA、IgG、IgM水平逐渐升高，IL-10、TGF-β水平逐渐下降，提示灵芝三萜可增强鼻咽癌小鼠免疫功能，推测这是灵芝三萜抑制鼻咽癌生长的机制之一。肿瘤免疫反应主要指细胞免疫反应，以T细胞亚群为主导，包括CD3＋、CD4＋、CD8＋等。CD3＋是成熟T细胞特征性标志，代表T淋巴细胞总数；CD4＋是辅助性T细胞，主要辅助B细胞生成抗体，发挥杀瘤作用；CD8＋细胞为抑制性T细胞，对细胞免疫有负调节作用，可对靶细胞产生细胞毒作用，抑制免疫作用。CD4＋/CD8＋比值降低提示机体处于免疫抑制状态，可能诱发或加快肿瘤生长。脾脏在鼻咽癌患者细胞免疫中占主导地位，故本研究观察了脾脏T淋巴细胞亚群分化情况。结果显示从模型组到低剂量组、高剂量组、干扰素组，小鼠脾脏CD3＋、CD4＋T淋巴细胞占比及CD4＋/CD8＋比值依次升高，提示灵芝三萜可提高T淋巴细胞标志物水平，进一步表明灵芝三萜可刺激细胞免疫，带动整个机体免疫力恢复。

综上所述，灵芝三萜可提高鼻咽癌小鼠胸腺指数和脾脏指数，提高血清IgA、IgG、IgM水平，降低血清IL-10、TGF-β水平，抑制肿瘤生长，其作用机制可能与调节T细胞亚群分化，增强鼻咽癌小鼠免疫功能有关。