Box-Behnken设计-响应面法优化复方白鲜皮湿疹方提取工艺*

魏其云，甄世福，杨志军，赵小梅，徐丽波，袁 丽，杨 娟

（1.兰州市中医医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；3.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000）

复方白鲜皮湿疹方，为兰州市中医医院结合多年临床经验筛选参合而成的经验方，由白鲜皮、地肤子、苦参、马齿苋、蛇床子、蒲公英、金银花等12味药材组成，具有清热凉血、收湿敛疮、止痒的功效，主要治疗湿疹、湿疮等，临床疗效确切[1-3]。方中白鲜皮具有清热燥湿、祛风解毒的功效，主要活性成分为白鲜碱、黄柏酮和柠檬苦素[4]；地肤子具有利尿消肿、清热、祛湿的功效，主要活性成分为三萜皂苷及甾类化合物[5]。复方白鲜皮湿疹方目前只能以传统汤剂对患者熏蒸或热敷，其临床使用范围受限。为了更好地开发该方，本研究拟采用制剂新技术对该处方进行二次开发，通过改变剂型进一步扩大临床应用范围，增加临床患者适用性。

Box-Behnken设计-效应面法[6]建立非线性的数学模型，预测性好，试验精度高，结果直观，适用于多因素、多水平的试验。目前该方法已被广泛应用于中药学研究领域[7-11]。基于此，本研究以复方白鲜皮湿疹方的主要有效成分绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱含量的总评归一值（OD值）[12]为主要考察指标，以乙醇浓度、提取时间、提取次数、溶剂倍数为考察因素，采用单因素试验结合Box-Behnken设计-响应面法优化复方白鲜皮湿疹方的提取工艺[13-14]，以期为复方白鲜皮的相关制剂研发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器Agilent1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；XSE205DU型电子天平（赛多利斯公司）；101-1AS型电热鼓风干燥箱（北京科伟）；HH-S型数显恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗机（昆山舒美）。

1.2 试药绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110822-201817）；白鲜碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111654-200301）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水均为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验色谱柱：Inertsil氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.1%甲酸水溶液（89∶11）为流动相；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL。在上述色谱条件下进样，绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱的色谱峰均按要求达到基线分离，分离度＞1.5，且其他成分与以上色谱峰之间无干扰。理论塔板数按白鲜碱峰计算均不低于5 000。

2.2 方法学考察

2.2.1 混合对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品11.04 mg、盐酸小檗碱对照品8.01 mg、白鲜碱对照品5.03 mg，采用甲醇溶解并分别定容至10、10、5 mL容量瓶中，制得质量浓度分别为1.104 0、0.801 0、1.006 0 mg/mL贮备液，备用。

分别精密吸取绿原酸贮备液5.0 mL、盐酸小檗碱贮备液2.0 mL、白鲜碱贮备液1.5 mL置于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液，备用。进样色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液的HPLC图谱

2.2.2 供试品的制备 制备工艺：按处方比例称取适量药材，以药材8倍量80%的乙醇为提取溶剂，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后滤过，合并滤液，冷却，即得供试品。

供试品溶液的制备：取上述滤液10 mL，蒸干，适量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样，色谱图见图2。

图2 供试品溶液的HPLC图谱

2.2.3 阴性对照溶液的制备 制备工艺：除金银花、白鲜皮、蒲公英、黄柏外，按处方比例称取其余药材，以药材8倍量80%的乙醇为提取溶剂，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后滤过，合并滤液，冷却，即得阴性对照。

阴性对照溶液的制备：取上述滤液10 mL，蒸干，适量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样，色谱图见图3。

图3 阴性对照溶液的HPLC图谱

2.2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL置于5 mL容量瓶中，分别加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下色谱条件进样，以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得线性回归方程：Y绿原酸=23 897X+9.738 7（R=0.999 8）、Y盐酸小檗碱=25 130X+87.942（R=0.999 6）、Y白鲜碱=5 559.1X+68.708（R=0.999 2）；结果表明绿原酸在0.01104～0.17664mg/mL、盐酸小檗碱在0.003204～0.051 264 mg/mL、白鲜碱在0.003 018～0.048 288 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算绿原酸、盐酸小檗碱及白鲜碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.19%、0.06%、0.02%，说明该仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下的同一供试品溶液6份，分别室温放置0、2、4、6、8、12 h，以“2.1”项下色谱条件进样分析，求得绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱峰面积的RSD分别为0.09%、0.06%、0.05%。结果表明在12 h内供试品溶液性质稳定。

2.2.7 重复性试验 精密称定6份同一样品粉末，用甲醇30 mL，超声提取30 min，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL容量瓶中。按“2.1”项下条件进样测定，样品绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.02%、0.03%、0.05%，说明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取9份同一批已知含量的供试品溶液，精密加入一定量对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备9份样品溶液，依法进样测定，根据“2.2.4”项下标准曲线计算回收率，绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱平均回收率分别为96.20%、95.95%、96.46%，RSD分别为1.17%、0.73%、0.49%，均小于2%，符合要求。（见表1）

表1 加样回收率试验

2.3 单因素试验设计及结果以白鲜碱、绿原酸、盐酸小檗碱的含量为评价指标，通过考察不同溶剂倍数（6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取次数（1次、2次、3次）和提取时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h）4个因素对提取效果的影响[15]，为响应面试验因素水平的选择提供依据。单因素试验结果见图4。

由图4A可知，白鲜碱的含量随着溶剂用量的增加变化不明显，绿原酸的含量先增高后降低，盐酸小檗碱的含量先降低后缓慢升高。综合考虑影响因素，最终选择溶剂倍数6、10、12为该因素水平。

由图4B可知，随乙醇浓度的增加，白鲜碱和绿原酸的含量均先缓慢升高再下降，盐酸小檗碱含量先下降再升高最后趋于平稳。综合考虑，最终选择乙醇浓度50%、60%、80%为该因素水平。

由图4C可知，绿原酸的含量随提取次数增加而增加，白鲜碱、盐酸小檗碱的含量随提取次数的增加变化不大。综合考虑，最终选择提取次数1、2、3为该因素水平。

由图4D可知，盐酸小檗碱含量随提取时间增加而增加，绿原酸和白鲜碱含量随提取时间增加而升高，但变化不明显。综合考虑，最终选择提取时间1.0、1.5、2.0 h为该因素水平。

图4 单因素试验结果

2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化制备工艺

2.4.1 BBD试验设计结果 通过前期单因素试验，不同因素及水平值已确定，以乙醇浓度（A）、溶剂倍数（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为自变量，以绿原酸、白鲜碱、盐酸小檗碱含量的OD值为响应值，运用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken响应面设计4因素3水平试验方案，见表4。

表4 星点试验因素水平表

采用Design-Expert 8.05b软件的星点设计方案安排复方白鲜皮湿疹方提取工艺条件，对白鲜皮湿疹方提取工艺进行优化确定，确定最佳提取工艺条件。试验设计及结果见表5。

表5 BBD实验设计及结果

2.4.2 模型拟合及方差分析 应用Design Expert 8.0.6软件，OD值为响应值，分别对四个因素即乙醇浓度（A）、溶剂倍数（B）、提取时间（C）、提取次数（D）进行数据拟合分析，得到回归方程：Y=-12.205 20+0.074 857A+1.291 06B+3.681 15C+8.053 65D-2.081 88E-003AB-9.119 49E-004AC-3.531 76E-003AD+0.049 842BC-0.115 59BD-0.219 87CD-4.520 64E-004A2-0.044 506B2-0.912 86C2。回归模型方差分析[13]结果见表6。

由表6可知，P＜0.000 1，失拟项P＞0.05，说明此模型显著高且拟合程度良好，对提取制备工艺的分析与预测可以用该模型。A和C无显著性影响，B和D因素有显著性影响（P＜0.01）。以上结果表明，各因素对该方有效成分提取率的影响并不是单纯的线性关系，对其提取工艺显著性影响由大到小的排列顺序应为D＞B＞C＞A。

表6 方差分析

续表6：

2.4.3 响应面优化提取工艺及预测 根据回归方程拟合模型，固定4个变量中的2个变量，利用软件Design-Expert 8.0.6，绘制另外两个变量对OD影响的三维响应面图，可以更直观反映响应值与各因素以及各因素之间的交互关系。（见图5）

图5 OD值与A、B、C、D四个因素的三维响应面

经Design-Expert软件分析，最优制备工艺为参数为：乙醇浓度50%，溶剂倍数10.86，提取时间1.96 h，提取次数2.75。根据实际运行情况，选取乙醇浓度50%、溶剂倍数11倍，提取时间2 h，提取次数3次。

2.5 验证试验及结果按处方量称取苦参、地肤子、蛇床子、马齿苋、白鲜皮、蒲公英、金银花等12味药材3份，以所选最佳工艺提取条件进行平行3次的验证试验。结果显示，绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱平均含量分别为0.703%、0.241%、0.155%，绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱的OD值为11.27，与预测值11.19比较，偏差为-0.71%。结果表明该回归模型建立合理，具有良好的预测性。

3 讨 论

湿疹是由多种内外因素引起的瘙痒剧烈的一种皮肤炎症反应[16]。现代药理研究表明，本处方中的有效成分绿原酸[17]和盐酸小檗碱[18]都具有明显的抑菌作用，且盐酸小檗碱具有止痒功效[19]。单一指标优化可以根据试验结果直接进行判断，而多指标之间存在一定的交互作用，多个指标同时处理与每个评价指标单独处理得到的优化结果具有差异性，因此我们引入总评归一值（OD）。本研究采用数学方法将绿原酸、盐酸小檗碱和白鲜碱3个指标综合考虑，对所有量化指标进行客观分析，让模型具有更好的预测性；通过单因素试验，考察并筛选出绿原酸、盐酸小檗碱、白鲜碱3个有效成分作为考察指标，并采用OD值综合指标数据。本研究在减少Box-Behnken设计-响应面试验的因素和减少试验次数的同时，可避免发生因试验设计点选取不当而超出实际条件的情况，以此保证优化结果的良好性。

本研究利用单因素试验和BBD-RSM优化传统复方白鲜皮湿疹方的制备工艺[20-21]，再经试验验证，在最优工艺参数下提取到的样品有效成分含量高，且实测值与预测值有较小偏差。结果显示Box-Behnken设计-响应面法具有较为良好的预测性，可用于复方白鲜皮湿疹方提取工艺的优选。