气相色谱法同时测定砂仁叶油中β-丁香烯与β-蒎烯的含量*

张怡评，施丽君，张红红，方 华，晋文慧，陈伟珠，李忠思，邱远望

（1.自然资源部第三海洋研究所/海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建 厦门 361005；2.福建中特药业有限公司，福建 泉州 362712）

砂仁叶油为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.的新鲜叶片经水蒸气蒸馏得到的挥发油，为淡黄色澄清液体，味辣，气辛而有砂仁香气。砂仁叶具有行气、健胃、消胀、止呕等功效，可用于脾胃虚寒、脘腹胀痛、恶心呕吐、消化不良等，收载于1977年版《中华人民共和国药典》[1-2]。现代研究表明，砂仁叶油具有促进家兔皮肤创面愈合[2]，促进大鼠幽门结扎性溃疡愈合[3]，以及清除超氧阴离子和羟自由基的作用[4]。临床研究表明其具有治疗溃疡病、胃肠炎所引起的腹痛、呕吐等作用[5]。同时，由砂仁叶油作为主要成分的制剂“砂仁驱风油”有祛风行气、消炎镇痛的功效，临床用量较大[6]。砂仁叶油主要含伪柠檬烯、3-蒈烯、d-柠檬烯、桃金娘烯醇、β-丁香烯和β-蒎烯等多种成分[2，7]。然而，目前尚未见同时测定砂仁叶油中β-丁香烯与β-蒎烯方法的研究报道，对砂仁叶油的质量控制缺乏定性定量检测方法。研究发现，砂仁叶油中β-丁香烯与β-蒎烯具有抗菌、消炎、止咳化痰等功效[8-11]，可作为砂仁叶油中指标性成分。本研究建立了砂仁叶油中β-丁香烯与β-蒎烯含量测定方法，为砂仁叶油质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器GC-6890气相色谱仪（美国Agilent公司），配FID检测器；HP-5毛细管色谱柱（美国Agilent公司）；SQP型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 材料砂仁叶油（本实验室自制，砂仁叶采自漳州长泰，经福建中医药大学黄鸣清教授鉴定为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.的新鲜叶）；β-丁香烯对照品（批号：111819-201703）、β-蒎烯对照品（批号：110897-201803）（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，TEDIA公司）；无水硫酸钠（西陇科学股份有限公司，批号：180408）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件GC-6890气相色谱仪和气相色谱工作站，FID检测器；毛细管色谱柱为Agilent HP-5（30m×0.32mm，0.25 μm）；进样口温度为250℃；程序升温为Agilent初始80℃，以8℃/min升温速率升至200℃（保持5 min）；进样量为1 μL；分流比为10∶1；载气为高纯氮；流速为1 mL/min；尾吹为30 mL/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取β-丁香烯对照品与β-蒎烯对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL含β-丁香烯为457.2 μg/mL、β-蒎烯736.3 μg/mL的混合对照品储备液，摇匀，即得。

2.2.2 砂仁叶油供试品溶液的制备 取砂仁叶油50 mg置于10 mL容量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得供试品溶液。

2.3 系统适用性分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各1 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果显示β-丁香烯与β-蒎烯与其他组分峰均能基线分离，分离度>1.5；β-丁香烯与β-蒎烯的理论塔板数均在5 000以上，色谱图见图1。

图1 气相色谱图

2.4 线性关系考察取“2.2.1”对照品储备液，依次稀释，分别配置成含β-丁香烯分别为457.2、228.6、114.3、57.2、28.6、14.2、7.1 μg/mL和 含β-蒎 烯736.3、368.2、184.1、92.0、46.0、23.0、11.5 μg/mL的系列混合对照品溶液，各吸取1 μL分别注入气相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。分别以β-丁香烯与β-蒎烯的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线方程分别为β-丁香烯：Y=2.273 4X-13.360 0（R2=0.999 5），β-蒎烯：Y=1.604 1X-6.450 1（R2=0.999 7），由此可见β-丁香烯与β-蒎烯分别在质量浓度为7.1～457.2 μg/mL和11.5～736.3 μg/mL范围内线性良好。

2.5 精密度试验按照“2.4”项下方法，制备β-丁香烯与β-蒎烯质量浓度分别为228.6 μg/mL和368.2 μg/mL的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果显示β-丁香烯与β-蒎烯峰面积RSD分别为0.88%（n=6）和0.45%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验按照“2.4”项下方法，制备β-丁香烯与β-蒎烯分别为228.6 μg/mL和368.2 μg/mL的混合对照品溶液，分别于0、3、6、9、12、18、24 h按照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果β-丁香烯与β-蒎烯峰面积RSD分别为0.89%和0.96%。表明β-丁香烯与β-蒎烯在24 h内基本保持稳定。

2.7 重复性试验精密称取砂仁叶油80 mg 6份，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取上述供试品溶液各1 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果β-丁香烯与β-蒎烯的RSD分别为0.56%和0.70%，表明重复性良好。

2.8 加样回收率试验取β-丁香烯与β-蒎烯适量，精密称定，加入甲醇至刻度，配制成β-丁香烯与β-蒎烯质量浓度分别为1.19 mg/mL和1.03 mg/mL混合对照品溶液。另取砂仁叶油40 mg 6份置于10 mL容量瓶中，精密称定，分别加入1 mL的混合对照品溶液，用甲醇溶解并稀释至刻度，按照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果β-丁香烯与β-蒎烯平均回收率分别为98.35%和98.64%，RSD分别为2.86%和1.82%。（见表1）

表1 加样回收率试验结果

2.9 定量限与检测限取β-丁香烯与β-蒎烯混合对照品溶液，适当稀释并检测，获得信噪比约为3或者10的对照品浓度值。结果表明β-丁香烯定量限和检测限分别为0.51 ng和0.17 ng；β-蒎烯定量限和检测限分别为1.22 ng和0.37 ng。

2.10 系统耐用性

2.10.1 不同升温程序对测定结果的影响 考察不同程序柱温（70～190℃、80～200℃、90～210℃、100～220℃、100～200℃）对分离效果的影响。结果表明在不同柱温下，β-蒎烯和β-丁香烯分离效果差异不大，但总体上80～200℃的峰形更优，故选择升温程序80～200℃。

2.10.2 不同色谱柱对测定结果的影响 考察不同色谱柱（Agilent HP-5、Agilent DB-FFAP）对分离效果的影响，结果表明2种色谱柱理论塔板数均大于5 000，分离度均大于1.5，测定结果的RSD均小于1.0%，表明2种色谱柱均可用于砂仁叶油中β-蒎烯和β-丁香烯测定。

2.10.3 不同操作者影响 由3个不同操作者在同一实验室采用同一设备进行砂仁叶油中β-蒎烯和β-丁香烯质量分数测定，测定结果的RSD小于2%，结果准确可靠。

2.11 含量测定精密称取砂仁叶油80 mg 6份，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取上述供试品溶液各1 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果砂仁叶油β-丁香烯平均质量分数为3.16%，β-蒎烯平均质量分数为2.28%。（见表2）

表2 砂仁叶油含量测定结果（%）

3 讨 论

中药砂仁一般以果实入药，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效[12-13]，其主要的功效成分为砂仁挥发油，具有抗溃疡、促进胃肠蠕动、胃肠保护等药理作用[14-15]。砂仁叶油具有与砂仁挥发油类似功效，临床上曾用于治疗消化性溃疡、急性肠胃炎、恶心呕吐、急慢性肝炎及手术等引起的腹胀、腹痛等，单方及复方制成香砂六君子丸均有疗效[5,16]。砂仁叶油临床单方应用具有与砂仁相似的功效，其止呕作用优于止痛作用，并且其止痛作用优于砂仁[5,17]。然而，由于产地不同，造成砂仁叶油化学成分组成及含量存在一定的差异，给临床应用造成一定的安全隐患[7]。研究发现，砂仁叶油中含有的β-丁香烯与β-蒎烯具有抗菌、消炎、止咳化痰等功效[8-11]，可作为砂仁叶油质量控制的指标性成分。本研究建立了砂仁叶油中β-丁香烯与β-蒎烯的含量测定方法，结果表明，该方法的专属性、精密度、稳定性、重复性、平均回收率及定量限等均符合《中华人民共和国药典》要求，可作为砂仁叶油质量控制的检测方法。