大孔树脂富集天麻酚类成分的工艺研究*

瞿晓梅，李紫嫣，刘 芳，赵 婷，刘玉璇，国大亮

（天津中医药大学，天津 301617）

天麻为兰科天麻属植物天麻Gastrodia elata Bl.的根茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效[1]，是名贵中药材。研究发现，天麻酚类化合物是天麻已知化学成分中总占比最多的成分类群，占天麻已知物质的52%，包括31%的酚类化合物和21%的柠檬酸酯类[2]。天麻素、4-羟基苯甲醇、香草醇、香草醛和巴利森苷等为研究较深入的药效成分。这些酚类活性成分可改善学习记忆力，可能与调节多种神经递质、细胞生长因子及相关受体功能的表达有关[3-10]，对阿尔兹海默病[11-12]、帕金森病[13-15]等中枢神经系统疾病有潜在治疗作用。

通过检索天麻纯化相关文献，发现现有研究多集中于天麻多糖[16-18]、天麻复方[19-20]或天麻素单体[21-22]的纯化工艺，对天麻酚类这一主要活性组分的纯化鲜有研究。本实验拟通过大孔树脂纯化富集天麻酚类成分，以天麻总酚、天麻素（gastrotin，GAS）和4-羟基苯甲醇（4-hydroxybenzenyl alcohol，HBA）三者为综合考察指标，筛选对天麻酚类成分吸附、解吸性能较好的大孔树脂型号，在此基础上优选出最佳纯化条件，为天麻酚类成分的开发、利用提供基础。

1 材料与仪器

1.1 试药 天麻由河北大中药业有限公司提供，经天津中医药大学中医学院刘玉璇教授鉴定为四川冬天麻。

1.2 试剂 没食子酸对照品（批号：110831-201906，纯度：≥98%，中国食品药品检定研究院）；天麻素对照品（批号：CFN99549，纯度：≥98%）、4-羟基苯甲醇对照品（批号：CFN97071，纯度：≥98%）（ChemFaces公司）；福林酚试剂（北京索莱宝科技有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；大孔吸附树脂HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5（北京索莱宝科技有限公司），具体参数见表1；无水碳酸钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。

表1 不同型号大孔树脂的相关性质

1.3 主要仪器HH-2型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）；UV-2540型紫外分光光度计（日本岛津）；LC2000高效液相色谱仪（上海天普分析仪器有限公司）；SQP电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；HY-2型调速多用振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

2 方 法

2.1 天麻酚类成分的提取 将天麻粉碎过60目筛得天麻粉末。精密称定一定量天麻粉，置于具塞三角瓶中，加入10倍量59%乙醇，在54℃的水浴锅内热浸提取89 min，过滤得天麻酚类成分提取液。将提取液置于旋转蒸发仪中减压浓缩至无乙醇旋出，得浓缩液。将浓缩液置于容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即得供试品溶液。

2.2 含量测定方法

2.2.1 天麻总酚的含量测定 采用福林酚比色法检测天麻总酚的含量。福林酚试剂中的钨钼酸可将酚类化合物定量氧化，自身还原成蓝色化合物，蓝色的深浅程度与含酚基团的数目成正比。没食子酸由于性质稳定，有3个酚羟基，常作为评估化合物中酚类含量的参照物。分别移取没食子酸对照品供试品溶液0.4 mL于10 mL具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，加福林酚试剂0.6 mL，混匀，加20%碳酸钠溶液1.0 mL，用水稀释至10 mL，摇匀后于40℃水浴加热至40 min，取出，放置10 min待溶液恢复至室温，于765nm下检测溶液吸光度。

2.2.2 天麻素和4-羟基苯甲醇的含量测定 色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；检测波长为220 nm；进样量为20 μL。

2.3 天麻酚类纯化工艺考察

2.3.1 大孔树脂的预处理 将不同型号大孔树脂分别用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀。用95%乙醇淋洗至流出液与水混合（1∶3）不呈白色混浊为止，然后以大量蒸馏水洗至无醇味。以5%HCl浸泡4 h，滤过，用蒸馏水洗至中性；再以5%NaOH浸泡4 h，滤过，用蒸馏水洗至中性，备用。

2.3.2 大孔树脂型号的筛选 选择HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5 5种大孔树脂，以天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的吸附率和解吸率为指标，采用静态吸附实验筛选最优大孔树脂类型。

分别精密称取5种大孔树脂HPD100、ADS-17、AB-8、D301、X-5各2 g分别装于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入供试品溶液20 mL，于25℃下100 r/min振荡24 h，使树脂充分吸附后滤过；测定上清液中剩余天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量，计算5种型号大孔树脂的静态吸附量和静态吸附率。

C0：吸附前天麻总酚质量浓度；C：吸附平衡后天麻总酚质量浓度；V：上样溶液体积；m：树脂质量

将上述吸附饱和的树脂取出，用蒸馏水冲洗去表面残留的液体，用滤纸吸干树脂表面的液体，置于干燥的具塞锥形瓶中，加70%乙醇30 mL，于25℃下以100 r/min振荡24 h使其充分解吸，解吸液滤过；测定洗脱液中天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量，计算5种型号大孔树脂的静态解吸率。

CV：洗脱液中天麻总酚质量浓度；V2：洗脱液体积；C0：吸附前天麻总酚质量浓度；C：吸附平衡后天麻总酚质量浓度；V：上样溶液体积

通过比较5种型号大孔树脂的静态吸附和解吸性能进行筛选。

2.3.3 上样条件考察

2.3.3.1 上样液pH值考察 精密称取5份处理好的HPD100树脂2 g，分别置于150 mL具塞锥形瓶中。各取5份15 mL的样品溶液（0.15 g生药/mL），用稀磷酸和碳酸钠溶液调节pH值至3、4、5、6、7，倒入锥形瓶内，于25℃下100 r/min振荡24 h，使树脂充分吸附后滤过，测定吸附前后样品中剩余天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量，比较5种pH值下大孔树脂吸附天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的吸附率。

2.3.3.2 上样液浓度考察 精密称取5份处理好的HPD100树脂2 g，分别置于150 mL具塞锥形瓶中，分别加入15 mL不同质量浓度的样品（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g生药/mL），于25℃下100 r/min振荡24 h，使树脂充分吸附后滤过，测定吸附前后样品中剩余天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量，比较5种质量浓度下大孔树脂吸附天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的吸附率。

2.3.3.3 上样液流速考察 取处理好的HPD100大孔树脂100g，湿法装入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm），另取0.15 g生药/mL的供试品溶液100 mL，以不同流速0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 BV/h上样，收集流出液，测定流出液中天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的浓度，计算动态吸附量和动态吸附率。2.3.3.4上样量考察 取预处理后的大孔树脂100 g湿法装入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm），取0.15 g生药/mL的供试品溶液300 mL，以1.5 BV/h流速上样，分段收集流出液，每份10 mL，收集30份，测定每份中天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的浓度，绘制泄露曲线，确定上样量。

2.3.4 洗脱条件考察

2.3.4.1 洗脱剂体积分数考察 精密称取5份处理好的HPD100树脂2 g，分别置于150 mL具塞锥形瓶中，分别加入15 mL 0.15 g生药/mL的样品，于25℃下100 r/min振荡24 h，使树脂充分吸附后滤过，测定吸附后样品中剩余天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量。使用蒸馏水将充分吸附饱和的大孔树脂清洗至表面无残留，加入不同体积分数的乙醇溶液（10%、30%、50%、70%、90%）15 mL，于25℃下100 r/min振荡24 h，测定解吸附后样品中剩余天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量，比较不同体积分数洗脱剂下大孔树脂解吸天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的解吸率。

2.3.4.2 洗脱流速考察 精密称取5份处理好的HPD100大孔树脂各100 g，湿法装入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm）。100 mL 0.15 g生药/mL供试品溶液，以1.5 BV/h进行动态吸附，吸附完全后，用200 mL水冲洗，测定吸附量，再用300mL 30%乙醇分别以1、2、3、4、5BV/h进行解吸，计算解吸率。

2.3.4.3 洗脱剂用量考察 精密称取处理好的HPD100大孔树脂100g，湿法装入3.0cm×25cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm）。100 mL 0.15 g生药/mL供试品溶液，以1.5BV/h进行动态吸附，吸附完全后，先用200mL水冲洗，测定吸附量，再以30%乙醇500mL、3 BV/h的流速进行洗脱，每10 mL流出液收集一管，测定洗脱液中各管天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量。以管数为横坐标，天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量为纵坐标绘制洗脱曲线。

2.3.5 最佳工艺条件验证 精密称取处理好的HPD100大孔树脂100g，湿法装入3.0cm×25cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm），按照得到的最佳纯化工艺进行洗脱，测定纯化液中天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇的含量。

3 结果与分析

3.1 含量测定方法

3.1.1 天麻总酚的含量测定 精密量取没食子酸对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL按照上述方法显色后，以吸光度值（y）为横坐标，质量浓度（x）为纵坐标绘制标准曲线。得标准曲线方程为y=0.099 2x+0.021 5，R2=0.998 4，表明没食子酸在0～12.216 μg/mL范围内线性关系良好，可定量表征天麻总酚含量。（见图1）

图1 没食子酸对照品标准曲线

3.1.2 天麻素和4-羟基苯甲醇的含量测定 天麻素标准曲线方程为y=4 515.4x+19 887，R2=0.999 0；4-羟基苯甲醇标准曲线方程为y=9 730.7x+7 205.8，R2=0.999 7，表明天麻素和4-羟基苯甲醇在20.2～141.4 μg/mL、4.044～28.308 μg/mL范围内线性关系良好。（见图2）

图2 天麻素与4-羟基苯甲醇对照品标准曲线

图4 5种大孔树脂的静态解吸率

3.2 大孔树脂型号的筛选 静态吸附实验结果表明，AB-8和HPD100对3种成分的静态吸附量均较高；D301对天麻总酚的吸附量远高于其余4种树脂，可能由于其吸附色素能力较强，导致吸附后上清液的颜色较浅，影响比色法检测的准确度。由于HPD100对3种成分的解吸能力优于AB-8，故选定HPD100型大孔树脂。（见图3～4）

图3 5种大孔树脂的静态吸附量

3.3 上样条件考察 实验结果表明，不同pH值的上样液对HPD100吸附能力的影响不规律，因此选择提取液原液上样（pH=5）；随着上样液浓度增加，静态吸附率先降低后趋于不变，说明上样液浓度大于0.15 g/mL后，增加上样液浓度，HPD100对3种成分的吸附百分比基本相同。综合考虑，0.15 g/mL的上样液既能达到较大吸附量又不会造成药材的浪费，因此选择0.15 g/mL为最佳上样浓度。（见图5～6）

图5 上样液pH对吸附率的影响

图6 上样液浓度对吸附率的影响

由动态吸附实验可知，上样流速大于1.5 BV/h时，流出液中酚类成分的含量明显增加，可能由于流速过快，部分酚类成分未被吸附就流出树脂柱。由多酚泄露曲线可知，当上样量小于100 mL时，天麻酚类成分的泄露量极少；上样量超过100 mL时，流出液中酚类成分的泄露量明显升高，超过190 mL后上样量与泄露量达到动态平衡，此时大孔树脂吸附饱和。为避免药材浪费，选择上样流速为1.5 BV/h，上样量为100 mL。（见图7～8）

图7 上样流速对HPD100大孔树脂吸附能力的影响

图8 天麻酚类成分的泄露曲线

3.4 洗脱条件考察 实验结果表明，随着乙醇体积分数增大，酚类成分的解吸率先升高后降低，当乙醇体积分数为30%时解吸率最高，故选择30%乙醇为最佳洗脱剂。（见图9）

图9 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

实验结果表明，随着洗脱流速增加，天麻总酚和4-羟基苯甲醇的解吸率差别不大，天麻素的解吸率逐渐降低。考虑到纯化效率，选择3 BV/h为最佳洗脱流速。由洗脱曲线知天麻素和4-羟基苯甲醇在洗脱剂用量为150 mL时基本洗脱完全，总酚在洗脱剂用量为300 mL时基本洗脱完全。因此选择洗脱剂用量为300 mL。（见图10～11）

图10 洗脱流速对解吸率的影响

图11 天麻酚类成分洗脱曲线

3.5 最佳工艺条件验证HPD100型大孔树脂富集纯化天麻酚类成分的最佳条件为：100 g HPD100大孔树脂湿法装入3.0cm×25cm的玻璃柱中（装柱高度20cm），用100 mL 0.15g生药/mL提取液原液上样，上样流速为1.5 BV/h，洗脱剂为30%乙醇，洗脱体积为300 mL，洗脱流速为3 BV/h。

表2 验证试验结果

4 结 论

本研究以天麻总酚、天麻素和4-羟基苯甲醇三者的含量作为检测指标，比较5种树脂对天麻酚类成分的吸附、解吸性能，发现HPD100型大孔树脂最适合天麻酚类的富集。通过静态和动态吸附、解吸实验，确定最佳工艺为：100 g HPD100大孔树脂湿法装入3.0 cm×25 cm的玻璃柱中（装柱高度20 cm），用100mL0.15g生药/mL提取液原液上样，上样流速为1.5BV/h，再以30%乙醇300 mL、3 BV/h的流速进行洗脱。在此条件下得到的天麻酚类成分纯化物中天麻总酚含量为35.18 mg/g，天麻素含量为20.14 mg/g，4-羟基苯甲醇含量为4.13 mg/g。