左归丸促进K562细胞向红系分化的分 子 机 制*

赵汗青，张群秀，王文娟

（首都医科大学中医药学院，北京 100069）

肿瘤相关性贫血（cancer related anemia,CRA）为恶性肿瘤常见伴随疾病之一，是肿瘤患者在疾病发展及治疗过程中发生的贫血。临床主要表现为红细胞数及压积下降，血红蛋白浓度降低。患者可出现疲乏、头晕、食欲减退、消化不良、呼吸困难等症状。国内外研究表明，肿瘤患者贫血发生率为30%～90%[1-2]。贫血不仅对肿瘤患者的体能、精神状态和生活质量产生影响，还可引起肿瘤组织乏氧从而影响放化疗效果[3]，导致肿瘤耐药[4]，促进肿瘤转移[4]，增加患者死亡风险。据报道，肿瘤伴贫血患者的平均生存期可缩短20%～43%[5]。因此，贫血已成为肿瘤的一个独立预后不良因素[6]。

目前临床改善贫血的方法主要有治疗潜在病因、输注红细胞、补充铁剂、使用红细胞刺激因子等[7]，然而诸方法均存在一定的局限，导致抗贫血治疗尚不能达到满意的疗效。中医药改善贫血多从健脾补肾、益气养血入手，具有疗效稳定、副作用小等优势[8]。为进一步阐明补肾生血法改善贫血的机制，本研究采用具有红系分化潜能的人髓性红白血病K562细胞为模型，以补肾生血法代表方左归丸血清进行干预，通过检测细胞增殖、红系分化相关指标，明确其调控红系分化的机制，以期为临床有效防治肿瘤相关性贫血提供实验依据。

1 材 料

1.1 实验动物SPF级健康雄性SD大鼠16只，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物合格证号：110011191 1018409。将大鼠饲养在屏障级动物室，采用12 h循环照明，温度（25±1）℃，湿度70%，自由摄食、饮水，适应性饲养3 d。本研究经首都医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理编号：AEEI-2017-036。

1.2 细胞株K562细胞株（北京泰科兰博科技有限公司）。

1.3 药物与试剂 左归丸，方药组成：熟地黄24 g，炒山药12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，川牛膝9 g，菟丝子12 g，鹿角胶12 g，龟甲胶12 g，上述中药饮片购自北京同仁堂药店。

RPMI 1640不完全培养液（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KG023945）；胎牛血清（上海碧云天生物技术有限公司，批号：011717170405）；Cell Counting Kit-8试剂盒（日本同仁，批号：FH783）；瑞氏-吉姆萨复合染液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180201）；FITC anti-human CD71（BioLegend，批号：B253417）；FITC Mouse IgG2a,k Isotype Ctrl（BioLegend，批号：B269543）；Cell Staining Buffer（BioLegend，批号：B264524）；GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb（美国CST，批号：#5174）；GATA-1（D52H6）XP Rabbit mAb（美国CST，批号：#3535）；Anti-rabbit IgG HPR-linked Antibody（美国CST，批号：#7074）；Simply P总RNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司，批号：C528H1a）；Fast King cDNA第一链合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：#R7025）；SuperReal荧光定量预混试剂增强版（北京天根生化科技有限公司，批号：#R6620）。

1.4 主要仪器 定制型BD LSRFortessa SORP流式细胞分析仪（BD公司）；DM6000B型正置荧光显微镜及图像分析系统（Leica公司）；iD3型多功能基因蛋白检测仪（SpectraMax公司）；FUSION FX6 XT型凝胶化学发光成像分析系统（VIVILBER公司）；CFX96型荧光定量PCR仪（BIO-RAD公司）。

2 方 法

2.2 K562细胞分组、干预K562细胞培养于含RPMI 1640、10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素的完全培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下置培养箱中培养。

取对数生长期细胞，接种于培养板中，随机分为空白对照组、空白血清组、阳性对照组、左归丸血清组。空白对照组：在50%RPMI 1640完全培养基的基础上，加入50% RPMI 1640基础培养基；空白血清组：在50%RPMI 1640完全培养基的基础上，加入30% RPMI 1640基础培养基、20%空白血清；阳性对照组：在50%RPMI 1640完全培养基的基础上，加入49%RPMI 1640基础培养基、1% 50 mmol/L丁酸钠溶液；左归丸血清组：在50%RPMI 1640完全培养基的基础上，加入30%RPMI 1640基础培养基、20%左归丸血清。于培养箱中孵育48 h后收集细胞。

2.3 CCK8检测左归丸血清对细胞增殖活性的影响 取对数生长期细胞，调整密度为5×104个/mL，按100 μL/孔接种于96孔板中。分别加入5%、10%、15%、20%、25%左归丸血清，同时设空白对照组（无含药血清），每组3个复孔，于培养箱中分别培养24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，于培养箱中孵育2 h。酶标仪450 nm波长处测定OD值。

2.4 瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态 取对数生长期细胞，调整密度为4×105个/mL，按1 mL/孔接种于6孔板中，加药孵育48 h后收集细胞。离心去上清，PBS清洗2次，加PBS缓冲液50 μL重悬细胞。取10 μL细胞悬液滴在多聚赖氨酸黏附载玻片上，制成细胞涂片。涂片用4%多聚甲醛固定30 min，滴加瑞氏-吉姆萨染液，光镜下观察细胞形态。

2.5 光镜下计数联苯胺蓝染细胞阳性率 取对数生长期细胞，调整密度为4×105个/mL，按1 mL/孔接种于6孔板中，每组3个复孔，加药孵育48 h后收集细胞。离心去上清，PBS清洗2次，加PBS缓冲液400 μL重悬细胞。联苯胺染液和30%H2O2以50∶1混合，于96孔板中加9 μL染液和81 μL细胞，混合均匀，室温静置5 min。显微镜下计数200个细胞，计算蓝染细胞阳性率（%）。

2.6 酶标仪检测血红蛋白含量 取对数生长期细胞，调整密度为4×105个/mL，按1 mL/孔接种于6孔板中，每组3个复孔，分别加药孵育24、48 h后收集细胞。4℃1 000 r/min离心10 min，去上清液。PBS清洗1次，去上清。细胞中加入70 μL联苯胺溶液、70 μL 1%H2O2，混匀，4℃避光染色30 min，加入10%乙酸700 μL。按200 μL/孔加入96孔板中，酶标仪490 nm波长处测定OD值。

2.7 流式细胞仪检测CD71表达情况 取对数生长期细胞，调整密度为4×105个/mL，按1 mL/孔接种于6孔板中，在原分组基础上增加ISO同型对照，每组3个复孔。加药孵育24 h后收集细胞，离心去上清。用Cell Staining Buffer清洗2次，去上清。ISO组加入0.4 μL Isotype、99.6 μL Cell Staining Buffer，其余组分别加入2 μL CD71抗体、98 μL Cell Staining Buffer，4℃避光静置15 min。用Cell Staining Buffer清洗2次，去上清液。加入500 μL Cell Staining Buffer重悬细胞，上流式细胞仪检测细胞表面CD71荧光强度，分析CD71表达率（%）。

1990年新年，憨豆先生再次出现。原本这仅仅是一次喜剧表演。但该角色取得了成功，20世纪90年代，艾金森又拍摄了多部续集。最终，该剧被制作成为电影，艾金森从此成为国际影星。他的视觉喜剧风格让他获得了“带着橡皮脸的男人”的昵称。

2.8 Western blotting检测GATA-1蛋白表达情况 取对数生长期细胞，调整密度为1×106个/mL，按2 mL/孔接种于6孔板中，设6个复孔。加药孵育48 h后收集细胞，离心去上清，PBS洗2次。加入裂解液充分裂解，提取总蛋白。BCA试剂盒测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2 μg/μL。蛋白上样量20 μg，依次电泳、转膜、封闭。加入目的蛋白GATA-1一抗（用TBST以1∶1 000稀释）5 mL和内参蛋白GAPDH一抗（用TBST以1∶1 000稀释）5 mL，4℃孵育过夜，洗膜；加入二抗（用TBST以1∶1 000稀释）5 mL；洗膜，ECL发光采集图像。采用Image J软件计算条带灰度值，以GAPDH为内参，计算GATA-1蛋白相对表达量。

2.9 Real-time PCR检测GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达情况 取对数生长期细胞，调整密度为1×106个/mL。按1 mL/孔接种于6孔板中，设7个复孔。加药孵育48 h后收集细胞，2 500 r/min离心4 min，去上清，PBS洗2次。按照试剂盒操作提取总RNA，反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增。引物设计序列见表1。采用20 μL反应体系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.6 μL，2×Super Real Pre Mix Plus 10 μL，RNase-Free dd H2O 6.8 μL。扩增条件：95℃15 min预变性，95℃10 s变性，60℃20 s退火，72℃32 s延伸，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算K562细胞中促红细胞生成素（EPO）、促红细胞生成素受体（EPOR）、红系特异性转录因子-1（GATA-1）的mRNA相对表达量。

表1 引物设计

2.10 统计学方法 使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布者采用“均数±标准差”（±s）表示；组间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 左归丸血清不同浓度、干预时间对K562细胞增殖活性的影响 干预24、48、72 h，左归丸血清在5%～20%浓度范围内均存在着明显的量效关系，且随着左归丸血清浓度增加，K562细胞增殖活性逐渐降低。经统计分析，与空白血清组比较，各浓度左归丸血清组K562细胞增殖活性均明显降低（P＜0.05）。其中20%左归丸血清作用24 h和48 h抑制K562细胞增殖活性的效果最佳（P＜0.01）。（见图1）

图1 各组K562细胞增殖活性比较（n=3）

3.2 各组K562细胞形态比较 干预48 h，空白对照组K562细胞呈圆形，胞核较大，胞浆较少，核浆比较大；空白血清组和阳性对照组K562细胞呈圆形，胞核较大，胞浆较少，核浆比较大，与空白对照组差别不大；左归丸血清组与其他3组比较，细胞染色质固缩，胞核明显变小，胞浆丰富，核浆比降低。（见图2）

图2 各组K562细胞光镜形态比较（×1 000）

3.3 各组K562细胞血红蛋白含量比较 干预24 h，空白血清组、阳性对照组、左归丸血清组K562细胞血红蛋白含量均明显高于空白对照组（P＜0.01）；阳性对照组K562细胞血红蛋白含量低于空白血清组（P＜0.01）；左归丸血清组K562细胞血红蛋白含量明显高于阳性对照组（P＜0.01）。

干预48 h，空白血清组、左归丸血清组K562细胞血红蛋白含量均明显高于空白对照组（P＜0.01）；阳性对照组K562细胞血红蛋白含量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组K562细胞血红蛋白含量低于空白血清组（P＜0.01）；左归丸血清组血红蛋白含量明显高于阳性对照组（P＜0.01）。（见图3）

图3 各组K562细胞血红蛋白含量比较（x±s，n=3）

3.4 各组K562细胞血红蛋白表达阳性率比较 干预48 h，空白血清组、左归丸血清组K562细胞血红蛋白表达阳性率均明显高于空白对照组（P＜0.01）；阳性对照组K562细胞血红蛋白表达阳性率与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组K562细胞血红蛋白表达阳性率明显低于空白血清组（P＜0.01）；左归丸血清组K562细胞血红蛋白表达阳性率明显高于阳性对照组（P＜0.01）。（见图4）

图4 各组K562细胞血红蛋白表达阳性率比较

3.5 各组K562细胞红系分化标志CD71表达率比较 干预24 h，空白对照组表达CD71的K562细胞大多数小于103，空白血清组表达CD71的K562细胞平均分布于103两侧，阳性对照组表达CD71的K562细胞大多数小于103，左归丸血清组表达CD71的K562细胞大多数大于103。空白对照组、空白血清组、阳性对照组K562细胞CD71表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；左归丸血清组K562细胞CD71表达率明显高于空白对照组、空白血清组、阳性对照组（P＜0.05或P＜0.01）。（见图5）

图5 各组K562细胞CD71表达率比较

3.6 各组K562细胞红系分化相关蛋白GATA-1表达比较 干预48 h，与空白对照组比较，空白血清组、阳性对照组、左归丸血清组K562细胞GATA-1蛋白表达均明显上调（P＜0.05或P＜0.01）。（见图6）

图6 各组K562细胞GATA-1蛋白表达比较

3.7 各组K562细胞红系分化相关基因GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达比较 干预48 h，空白对照组、空白血清组、阳性对照组K562细胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；左归丸血清组K562细胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达均明显高于空白对照组、空白血清组和阳性对照组（P＜0.05或P＜0.01）。（见图7）

图7 各组K562细胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达比较

4 讨 论

肿瘤相关性贫血可造成患者预后较差，严重影响生存质量，是临床迫切需要解决的问题[2]。其发生机制主要是红细胞生成不足、破坏过多及失血[7]。原因主要有肿瘤所致贫血、肿瘤治疗相关性贫血、营养素缺乏所致贫血[8]。目前西医治疗贫血尚未达到满意效果，因此需积极寻找有效治疗手段。调控红系分化是近年抗贫血研究热点。红系分化是造血干细胞增殖、分化、发育为成熟红细胞的过程，该过程受细胞内多种基因和细胞因子调控，其中关键因素有EPO、EPOR、GATA-1等[9-11]。有研究报道，龟甲、丹参、党参、黄芪等中药，人参多糖、人参总皂甙、苦参碱、藤黄酸、甘草次酸等中药成分可促红系分化[12-18]。

中医学认为肿瘤相关性贫血患者常见面色少华、神疲乏力、头晕耳鸣、心悸失眠、食欲减退、舌淡暗、苔薄白、脉细弱无力等，基本病机为气血两虚，而其重要病机是脾肾亏虚、精血化生乏源[8]。肾藏精生髓，精血互化，髓能养血，因此补肾可促进血液化生。临床报道已证实[19-21]，采用补肾生血治疗贫血能取得明显的临床疗效。左归丸由熟地黄、枸杞子、山茱萸、龟甲胶、鹿甲胶、牛膝、菟丝子、山药组成，可补肾养阴、填精益髓，临床上多用来联合西药治疗再生障碍性贫血，有研究显示其疗效优于单纯西药组[22-23]；沈辉等[24]采用左归丸合当归补血汤治疗化疗后骨髓抑制，疗效也明显优于对照组。研究[25]显示，左归丸中熟地黄、山萸肉、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、龟甲等药均为临床治疗肿瘤相关性贫血常用药，但作用机制尚不明确。

本实验采用左归丸作为补肾生血法代表方，以具有分化潜能的红白血病K562细胞为模型，从红系分化角度进行机制研究。实验结果显示：左归丸血清干预24、48、72 h对K562细胞增殖具有显著抑制作用（P＜0.05），在5%～20%浓度范围内呈现出明显的量效关系；细胞涂片瑞氏-吉姆萨染色显示，左归丸血清干预后细胞染色质固缩，胞核变小，胞浆丰富，核浆比降低，呈现出成熟细胞的特点。20%左归丸血清作用24 h和48 h抑制细胞增殖的效果最佳（P＜0.01），且干预48 h的作用尤为突出，因此实验时间选择48 h或者24 h。

血红蛋白是红系标志之一，联苯胺可与血红蛋白发生反应而呈蓝色，镜下可见细胞蓝染，采用酶标仪可定量检测血红蛋白含量。K562细胞是未分化的原始细胞，血红蛋白含量较低。实验结果显示，左归丸血清干预后，K562细胞中表达血红蛋白的阳性细胞率明显上升，血红蛋白含量也明显增加（P＜0.01）。

CD71为转铁蛋白受体，与转铁蛋白结合后可介导细胞内铁摄取。随着造血干/祖细胞向红系分化，承担铁运输作用的血红蛋白合成逐渐增加，因此CD71表达逐渐升高，故CD71可作为红系分化标志。本实验结果显示，左归丸血清能明显升高K562细胞CD71表达率（P＜0.05），而CD71仅在24 h差异显著，48 h却差异不大，是否存在对于CD71的调节仅表现在24 h，原因仍待探究。

EPO为红系特异性细胞因子，与EPOR结合后可激活JAK-STATs、Ras等信号通路而刺激红系造血。在红系造血过程中，EPO首先诱导GATA-1、EPOR表达[9]。EPOR基因启动子中存在着特异性GATA-1结合元件，GATA-1与该元件结合后能激活转录EPOR基因，增加红系细胞对EPO的反应性[10]。GATA-1能特异性激活多种红系基因，诱导细胞向红系分化，促进红细胞发育成熟，并随红系分化成熟而上调[11]。可见GATA-1、EPO、EPOR之间存在着密切联系，共同促进红系分化。实验结果显示，左归丸血清可显著上调K562细胞中GATA-1蛋白表达（P＜0.01），同时还明显上调GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达（P＜0.01或P＜0.05）。

综上所述，左归丸血清可促进K562细胞向红系分化，其机制与调控GATA-1、EPO、EPOR表达有关。左归丸血清对K562细胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表达均有明显上调作用，对GATA-1的蛋白表达也有明显上调作用，对EPO和EPOR蛋白表达的影响尚不明确，这是下一步实验的研究方向。由于血清成分较复杂，目前尚不能明确是左归丸本身的药效作用，还是左归丸与血清的协同作用诱导K562细胞向红系分化，因此还需今后进一步从血清药理学角度开展深入研究。