HPLC-ELSD指纹图谱结合统计学评价不同产地苦楝皮药材质量*

童培珍，潘礼业，索彩仙，何广铭，何嘉莹，李国卫

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

2020年《中华人民共和国药典》规定苦楝皮为楝科植物川楝Melia toosendan Sied.et Zucc.或楝Melia azedarach L.的干燥树皮和根皮，具有杀虫、疗癣等功效；临床常用于蛔虫病、蛲虫病，虫积腹痛，外治瘙痒疥癣[1]。苦楝皮药材中主要含川楝素、苦楝酸、苦楝萜酸甲酯等三萜类及儿茶素类化合物[2-5]。苦楝皮的主要有效成分是川楝素，具有驱虫、抑制神经递质、抗肉毒等多种生物活性[6]。研究表明川楝素能够成功逆转人乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性，可作为一种新型的PI3K抑制剂，用于逆转乳腺癌的耐药性[7]。川楝素能够诱导肝细胞性肝癌细胞线粒体依赖性凋亡，故其在体内外具有抗癌作用[8]。目前，已有文献对不同部位及来源的苦楝皮药材含量或指纹图谱等方面进行研究，但仍缺乏综合性评价方法，未能全面评价苦楝皮药材质量[9-10]。近年来，采用质量分析结合统计学对中药材质量评价已较为成熟，该模式能全面反映中药材内在质量[11-12]。本研究采用HPLC-ELSD法对不同产地的苦楝皮药材特征图谱进行测定并比较，结合聚类分析和主成分分析对不同产地的苦楝皮药材进行质量分析，并同时测定川楝素含量，通过对不同产地的苦楝皮药材进行更全面的评价，以期为苦楝皮药材的综合质量控制提供参考。

1 材 料

1.1 仪器Waters ARC型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Alltech 3000型蒸发光散射检测器（美国Alltech公司）；XP26型百万分之一电子天平、ME204E型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HWS-28型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药 川楝素对照品（批号：111842-201804，含量：96.9%）、儿茶素（批号：110877-201604）、表儿茶素（批号：110878-200102）（中国食品药品检定研究院）；甲醇为分析纯；乙腈、甲酸均为色谱纯；超纯水为实验室自制。

苦楝皮药材共12批，购于广东、广西、湖北、安徽等地，经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为楝科植物楝Melia azedarach L.的干燥树皮，信息见表1。

表1 苦楝皮药材来源

2 方法与结果

2.1 苦楝皮药材特征图谱的建立

2.1.1 色谱条件Thermo Acclaim C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~15 min，8%~13%A；15~50 min，13%~55%A）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；蒸发光散射检测器：漂移管温度：110.0℃；载气流量：2.7 L/min。

2.1.2 对照品溶液的制备 取川楝素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含100μg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取样品粉末（过四号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，称定质量，加热回流30 min，取出，放冷，补质量，4 000 r/min离心10 min，精密移取上清液25 mL至蒸发皿中蒸干，残渣用70%甲醇溶解至5 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。结果显示各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、5、10、15、24 h进样测定，结果显示各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.4.3 重复性试验 取同一药材粉末（S1）约1.0 g，精密称定，平行6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定。结果显示各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.1.5 样品测定及分析

2.1.5.1 共有峰的确定 将得到的12批苦楝皮药材特征图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》进行匹配和共有峰标识，并生成对照图谱，见图1~2。以7号峰为参照峰，12批药材各共有峰相对保留时间RSD在0.01%~0.24%范围内，说明出峰时间较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步定为苦楝皮的指标成分。经对照品指认，共确定3个成分：5号峰（儿茶素），6号峰（表儿茶素），7号峰和8号峰（川楝素）。其中7号峰为其药理药效成分[3-4]，故选定为参照峰。12批苦楝皮相对峰面积RSD为6.80%~108.35%，其中S1~S6（广东、广西）6批苦楝皮药材峰3~峰6的相对峰面积较S7~S12（安徽、湖北）低，说明不同产地的药材存在一定差异，结果见表2。

表2 苦楝皮药材指纹图谱共有峰相对峰面积

图1 12批苦楝皮药材HPLC-ELSD指纹图谱叠加图

图2 12批苦楝皮药材HPLC-ELSD指纹图谱共有模式

2.1.5.2 指纹图谱相似度评价 以生成的共有模式为对照指纹图谱，12批样品的相似度在0.720~0.998范围内，除了S2、S3外，其余批次药材相似度均在0.900以上，说明不同产地药材整体质量较为稳定。（见表3）

表3 12批苦楝皮药材相似度评价结果

2.1.5.3 聚类分析 将12批苦楝皮色谱峰峰面积导入SPSS 20.0软件对4个产地药材样品进行聚类分析，采用组间联接法，选用欧氏距离进行聚类分析，结果见图3。结果表明，聚类分析可将12批苦楝皮主要分成2大类，Ⅰ类包括S1~S6、，即广东与广西样品为一类；Ⅱ包括S7~S12即安徽亳州、湖北襄阳样品为一类。总体看来，地理位置相近的样品可聚为一类，说明质量具有一定相似性，与相似度分析的评价结果相一致。

图3 聚类分析结果

2.1.5.4 共有峰主成分分析 对12批苦楝皮药材共有峰进行主成分分析，以8个共有峰峰面积为变量，采用SPSS 20.0软件进行标准化处理，计算主成分的特征值、方差贡献率及综合得分，对各产地的苦楝皮药材进行评价，见表4，碎石图见图4。由表4可知，前2个成分的特征值为5.120、2.106，均大于1，对总方差的累积贡献率达90.319%，可代表苦楝皮指纹图谱共有峰的大部分信息，故选择成分1、成分2作为第一、第二主成分。由碎石图可见曲线存在一个明显的拐点，说明前2个主成分基本体现出不同产地不同批次苦楝皮药材之间的相似度和差异性。初始因子载荷矩阵见表5，第一主成分载荷较高的有：峰3、峰4、峰5（儿茶素）、峰6（表儿茶素），第二主成分载荷较高仅有峰1（特征值大于0.8）。以第一、第二主成分为变量，得到投影图，见图5，前2名变量的权重值为0.966、0.947，对应峰5（儿茶素）和峰6（表儿茶素）。与上述分析结果一致，即可判定峰5、6为评价各产地苦楝皮药材质量的重要因素。

表4 主成分特征值及方差

表5 主要因子载荷矩阵表

图4 碎石图

图5 旋转空间中的成分图

2.1.5.5 综合评价 针对第一、第二主成分按方差贡献率加权计算综合得分，结果见表6。综合得分排名前3的样品均为安徽省亳州市；排名前6的样品中，安徽省亳州市3批、湖北省襄阳市2批、广东省广州市1批；排名前9的样品中，安徽省、湖北省、广东省产地的样品各3批。从综合评价得分来说，安徽省的苦楝皮药材质量较优，湖北省次之，广西省的苦楝皮药材质量相对较劣。

表6 综合得分排序表

2.2 苦楝皮药材含量测定

2.2.1 线性关系考察 精密称定川楝素对照品2.156 mg，加入10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为川楝素贮备液，精密量取上述川楝素对照品贮备液，用甲醇稀释为19.682、49.206、98.412、196.823、492.058μg/mL的 对 照 品 溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。川楝素线性回归方程及相关系数为y=1.653x+2.496，R2=0.999，结果表明在19.682~984.116μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 加样回收率试验 取已知含量的苦楝皮药材粉（S1）约0.5 g，精密称定，平行6份，加入与含量等量的对照品，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果川楝素的平均回收率为103.65%，RSD为3.81%。（见表7）

表7 加样回收率试验结果（n=6）

2.2.3 含量测定结果 精密吸取对照品溶液10、20μL及苦楝皮药材供试品溶液20μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算川楝素含量；根据2020年《中华人民共和国药典》“苦楝皮”项下测定苦楝皮药材川楝素含量，结果见表8。由结果可知，HPLC-ELSD法测定苦楝皮药材川楝素含量与UPLC-MS法测定含量偏差在5.0%以内，说明两者测定苦楝皮中川楝素含量测定结果无明显差异。总体来说，广东和广西的苦楝皮药材中川楝素含量（均值为0.122%）高于安徽省及湖北省（均值为0.054%），说明不同产地的苦楝皮药材存在质量差异。

表8 苦楝皮药材含量测定结果（%）

3 讨 论

川楝素为苦楝皮药材的有效成分，其紫外特征吸收波长为210 nm左右，属于末端吸收，紫外检测时基线波动较大，所用流动相为乙腈和甲酸水，甲酸紫外截止波长为210 nm，故容易受到干扰。且前期研究发现苦楝皮药材在210 nm波长下，HPLC指纹图谱色谱峰的个数少，不利于分析，而采用HPLCELSD法测定能有效解决上述问题。

HPLC-ELSD法和UPLC-MS法测定苦楝皮中川楝素含量偏差在5.0%以内，说明两者测定苦楝皮中川楝素含量测定结果无明显差异。UPLC-MS法测定含量准确度高，但其成本高于HPLC-ELSD法；HPLC-ELSD法不仅测定了苦楝皮中川楝素含量，也对苦楝皮药材指纹图谱进行测定，但HPLC-ELSD法灵敏度低于UPLC-MS法，且无法进行全波扫描，有可能存在色谱峰不纯情况。

本研究建立了4个产地的苦楝皮药材HPLC-ELSD指纹图谱共有模式，标定了8个共有峰，通过化学指认了其中的4个成分。对不同产地的苦楝皮药材HPLC-ELSD指纹图谱采用相似度、聚类和主成分进行分析。12批次苦楝皮药材的相似度范围为0.720~0.998，除了广东2批（S2、S3）小于0.900以外，其他各批次药材均在0.900以上，说明不同产地间的药材具有良好的相似度。聚类分析结果将苦楝皮药材分成两大类，总体来看，广东与广西苦楝皮药材质量大体相近，安徽省与湖北省苦楝皮药材质量大体相近。广东、广西产地和安徽、湖北产地的苦楝皮药材间存在较显著差异，广东、广西产地苦楝皮药材中川楝素整体含量高于安徽、湖北产地，而峰3~峰6相对峰面积远小于安徽、湖北产地，初步推断地理位置及气候导致广东、广西产地的苦楝皮药材中色谱峰7（川楝素）峰面积较安徽、湖北产地大，峰3~峰6（儿茶素类）峰面积较安徽、湖北产地小。苦楝皮主要含川楝素、苦楝萜醇内酯等三萜类化合物和儿茶素等多酚类化合物。由于广东省和广西省地处低纬度地区，主要为亚热带季风气候，其特点为夏长冬短，气温高，降水少，霜日少，日照多，雷暴频繁，全年水热同期，雨量充沛；而湖北省和安徽省地处中纬度，属于季风气候，均具有南北过渡地带的天气气候特征，气候温和，雨量适中，春寒多雨，秋高气爽，四季分明，春秋多变。所以可能为地理气候不同导致了苦楝皮药材所含成分的差异。从综合得分来说，安徽省的苦楝皮药材质量较优，湖北省次之，但苦楝皮主要用于治疗蛔、蛲虫病，虫积和疥癣瘙痒，其活性成分为川楝素[13-14]，因此，结合药理临床作用和含量测定结果，认为广东、广西产地的苦楝皮药材质量较优。

本研究建立了苦楝皮药材HPLC-ELSD指纹图谱方法，并同时测定了不同产地苦楝皮药材中川楝素含量，分析方法准确、可靠、专属性强，可为苦楝皮药材质量控制提供可靠的分析方法与参考依据。