HPLC波长切换法同时测定养心宁神丸中7种成分的含量*

王 超，付 鹏，郑 正

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

失眠困扰和威胁着人们的健康，严重影响了人们的正常生活。养心宁神丸由党参、炒酸枣仁、炒茯苓、丹参、远志等12味中药组方而成，具有养心益脾、镇静安神的作用，临床上主要应用于神经衰弱、心悸失眠、耳鸣目眩等疾病的治疗[1]。现行质量标准仅对其进行了鉴别和理化检查，未对任何成分进行定量检测，目前也仅检索到对该制剂中丹参所含两种成分进行了定量测定的文献报道[2]，由于养心宁神丸组方复杂，所含药味较多，单味药材所含1~2种成分的定量控制不能全面评价产品质量。方中重用党参补气健脾，龙眼肉补益心脾，养血安神，为君药；酸枣仁养心生津，宁心安神，莲子补脾滋元，养心安神，白术健脾益气，燥湿利水，山药补脾养胃，生津益肺，大枣补中益气，合为臣药；茯苓健脾和胃，宁心安神，丹参活血化瘀，清心除烦，凉血消痈，陈皮理气健脾，补而不滞，远志安神益智，石菖蒲开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃，共为佐使药。为更好地评价养心宁神丸的产品质量，本研究按照中药质量标志物确认原则，选取处方中君药党参，臣药炒酸枣仁，佐药炒茯苓为研究对象，采用HPLC波长切换法对养心宁神丸中党参所含主要活性成分党参炔苷、丁香苷，炒酸枣仁所含代表性成分酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，以及炒茯苓所含主要活性成分去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸成分含量进行同时测定，为全面评价养心宁神丸质量和提升养心宁神丸质量标准提供了科学的实验数据。

1 材 料

1.1 药物 养心宁神丸（规格：每丸重9g；批号：EH2401，EH2407，EH2411，广州白云山陈李济药厂有限公司）；阴性样品制备所用党参、丹参、炒酸枣仁、炒茯苓、制远志、大枣、炒山药、炒白术、石菖蒲、陈皮、炒莲子和龙眼肉药材均购于北京同仁堂安徽中药材公司，均符合《中华人民共和国药典》2015年版一部规定。

1.2 试剂 丁香苷对照品（批号：111574-201605，含量：95.2%）、酸枣仁皂苷A对照品（批号：110734-201914，含量：96.0%）、酸枣仁皂苷B对照品（批号：110814-201809，含量：96.2%）（中国食品药品检定研究院）；党参炔苷对照品（批号：PRF8092221，含量：99.0%）、氢土莫酸对照品（批号：PRF9042427，含量：90.2%）（成都普瑞法科技开发有限公司）；去氢茯苓酸对照品（批号：PS010107，含量：91.2%）、茯苓酸对照品（批号：PS010073，含量：99.7%）（成都普思生物科技股份有限公司）；所用试剂均为色谱纯，水为纯净水。

1.3 主要仪器Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；XS105型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备 取党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并制成质量浓度为0.812、0.254、0.338、0.192、0.146、0.118和0.352 mg/mL的混合对照品贮备液；精密吸取混合对照品贮备液2.5 mL，至50 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸质量浓度分别为40.6、12.7、16.9、9.6、7.3、5.9和17.86μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取养心宁神丸适量，剪碎，取约3.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理45 min，放冷后用甲醇定容至刻度，过滤制得养心宁神丸供试品溶液。

2.3 阴性样品溶液的制备 按养心宁神丸质量标准中的工艺处方，分别制备不含党参、不含炒酸枣仁、不含炒茯苓的阴性样品，再按上述方法制成阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温：30℃；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～9.0 min，14.0%A；9.0～17.0 min，14.0%A→31.0%A；17.0～26.0 min，31.0%A→59.0%A；26.0～42.0 min，59.0%A→92.0%A；42.0～50.0 min，92.0%A→14.0%A），流速：1.0 mL/min；检测波长：266 nm（0～17.0 min，检测党参炔苷和丁香苷）[3-5]、210 nm（17.0～50.0 min，检测酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸和茯苓酸）[6-9]；进样量：10μL。

2.5 专属性试验 精密吸取“2.1”“2.2”“2.3”项下各溶液依法进样检测，结果主成分党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸色谱峰峰形良好，主成分峰与相邻色谱峰均能完全分离，且分离度均＞1.5，阴性样品对养心宁神丸中7种目标成分的测定无干扰，色谱图见图1。

图1 HPLC图

2.6线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品贮备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置20 mL量瓶中，分别用甲醇制成系列混合对照品溶液，依法进样检测，记录党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的峰面积，以峰面积对质量浓度进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.7 精密度试验 取“2.1”项下混合对照品溶液重复进样6次，记录党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸色谱峰峰面积，再计算相应色谱峰峰面积的RSD分别为0.55%、0.72%、0.69%、0.87%、0.96%、1.01%和0.78%。

2.8 稳定性试验 取养心宁神丸同一份供试品溶液（批号：EH2401），于制备后0、2、4、7、12、18、24 h进样检测党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的峰面积，再计算相应峰面积的RSD分别为0.59%、0.68%、0.66%、0.90%、1.01%、0.98%和0.75%，结果表明养心宁神丸溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验 取同一批号养心宁神丸样品（批号：EH2401），按“2.2”项下方法制备供试品溶液6份，依法进样测定党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的峰面积，再计算相应含量的RSD分别为1.30%、1.64%、1.75%、1.89%、1.71%、1.83%和1.58%。

2.10 加样回收率试验 取已知含量的同一批养心宁神丸（批号：EH2401），剪碎，分成9份，每份约1.5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，按《中华人民共和国药典》2015年版四部要求，分别按已知含有量的50%、100%和150% 3个水平精密加入混合对照品溶液（党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的质量浓度分别为0.281、0.087、0.115、0.074、0.057、0.043、0.128 mg/mL）1.0、2.0和3.0 mL各3份，再按“2.2”项下方法制备样品溶液。在上述色谱条件下进行检测，结果所测成分党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的平均加样回收率（RSD）分别为99.58%（0.68%）、98.80%（1.51%）、97.98%（0.96%）、98.15%（1.48%）、96.69%（1.13%）、97.92%（1.34%）和100.07%（0.71%）。

2.11 样品含量测定 取养心宁神丸样品3批，按“2.2”项方法制备样品溶液（每批制备3份样品溶液），在上述色谱条件下进样检测，采用外标法计算党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量。检测结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨 论

3.1 供试品溶液制备方法的确定 本实验在确定供试品溶液制备方法时，首先选用甲醇[3-7,10-15]、乙醇[8-9]处理样品，采用超声处理[3-8,13-16]和加热回流[9]提取两种提取方式，以养心宁神丸中党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的提取效果为首选指标，同时兼顾杂质峰影响等因素，结果超声和加热回流提取效果差异不明显，由于加热回流操作复杂，超声提取相对简单易控制，故采用超声提取，而乙醇作为溶剂提取时去氢土莫酸和去氢茯苓酸提取率较低，故选用甲醇超声处理供试品。在用甲醇超声处理供试品时，对超声时间（15、30、45、60 min）进行了考察，结果发现超声45 min和60 min时的提取效率基本一致，为节省检测时间，同时节能降耗，最终确定供试品溶液制备方法为甲醇超声提取45 min。

3.2 流动相的选择 本实验在选择流动相时，首先选用最基础的甲醇-水和乙腈-水[3,5,9-11]流动相系统进行考察，结果发现甲醇-水流动相体系检测时，基线漂移严重，同时检测时间过长；乙腈-水流动相体系检测基线平稳，检测用时理想，不足之处是党参炔苷和茯苓酸含量较高，色谱峰出现拖尾现象，造成与相邻色谱峰不能完全分离，干扰检测结果；考虑加入酸类调节。经过分析，最终确定采用乙腈-0.05%磷酸[6-8,12-14]为流动相进行梯度洗脱，同时测定养心宁神丸中党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，基线平稳，主成分色谱峰峰形对称，与相邻色谱峰均能达到有效分离。

本实验采用HPLC波长切换法对养心宁神丸中7种成分党参炔苷、丁香苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸含量进行了同时测定，对所建立的方法进行了方法学验证，建立了养心宁神丸多指标成分质量控制模式，该方法可以为养心宁神丸质量标准提升和全面评价其产品质量提供参考依据。