葛根总黄酮联合三氧化二砷体外诱导NB4-R1细胞凋亡的实验研究

陈 婷，蔡亚云，沈 群

（1.如皋市人民医院，江苏 如皋 226500；2.南京中医药大学第一附属医院，江苏 南京 210029）

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓细胞性白血病的特殊亚型。全反式维甲酸和/或砷剂[特别是三氧化二砷（As2O3）]成功诱导APL细胞分化或凋亡是白血病治疗领域靶向治疗的成功典范，使高危白血病成为真正意义上可以治愈的一种白血病，然而维甲酸综合征和维甲酸耐药是部分诱导治疗失败的根源。近年来，从传统中药中寻找开发新型抗肿瘤药物已成为研究热点。目前针对抑制早幼粒细胞耐药细胞株NB4-R1增殖、诱导凋亡的特异性靶点的高效低毒的天然新药，报道鲜少。葛根总黄酮是从葛根提取出的黄酮类化合物，近年来通过体内外实验发现葛根总黄酮可以不同程度诱导多种白血病细胞株凋亡，已经证实了其抗白血病效应与凋亡通路密切相关[1-3]。本研究以低剂量葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）和/或联合As2O3（1μmol/L）体外诱导NB4-R1细胞凋亡，探讨低剂量葛根总黄酮联合As2O3对NB4-R1细胞增殖及凋亡的影响。

1 材 料

1.1 细胞系NB4-R1细胞由上海交通大学医学院附属瑞金医院惠赠，将NB4-R1细胞接种于约每瓶10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基[含青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）]中，置于恒温细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养。

1.2 试剂 葛根总黄酮（南京泽朗生物有限公司，纯度约为80%，货号：FY1238）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，货号：D5879）；RPMI 1640培养基（Sigma公司，货号：RNBH5043）；胎牛血清（GIBCO公司，货号：10099-141）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（Sigma公司，货号：M2128）；Annexin VFITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物技术有限公司，货号：KGA512）；As2O3溶液（哈尔滨伊达药业有限公司，规格：10 mg，10 mL，货号：2010-05-04）。葛根总黄酮溶于二甲基亚砜，-20℃保存，使用前用RPMI 1640培养基稀释至工作浓度。As2O3溶液原液稀释成1 mg/mL贮备液，-20℃下保存备用，使用前稀释成所需浓度。

1.3 主要仪器 酶标仪（BioTek公司，型号：FLX800）；恒温金属浴（杭州博日科技有限公司，型号：HB-T1）；旋涡混合器（北京海天友诚科技有限公司，型号：QL-901）；电子分析天平（赛多利斯有限公司，型号：BSA224S）；CO2培养箱（日本三洋公司，型号：MCO175M）；超净工作台（Thermo Fisher公司，型号：51029704）；台式超声细胞破碎仪（无锡沃信仪器有限公司，型号：VOSHIN-250W）；超纯水系统（美国Millipore公司，型号：Milli-RO Plus）；超低温冰箱（日本三洋公司，型号：MDF-382E）；电泳仪（BIO-RAD公司，型号：CHEF-DR）；半干转膜仪（BIO-RAD公司，型号：1703940）；高速离心机（德国Eppendorf股份有限公司，型号：5415D）；倒置显微镜（德国徕卡公司，型号：DMIL-PH1）。

2 方 法

2.1 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，以1×104/孔接种于96孔板，100μL/孔，加入葛根总黄酮，按照药物终浓度分为空白组、葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组、As2O3组（1μmol/L）、葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组，90μL/孔。分别培养24、48、72 h后，加入MTT溶液50μL，37℃孵育4 h，离心后去上清，加入100μL DMSO，室温震荡摇匀，酶标仪490 nm波长处测定吸光度（A490），实验重复3次。计算细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组A490-空白组A490）/（对照组A490-空白组A490）]×100%。

2.2 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 收集空白组、葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组、As2O3组（1μmol/L）、葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组的NB4-R1细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，1×PBS洗涤后调整密度为1×106/mL。加入500μL的Binding Buffer重悬细胞。加入Annexin V-FITC 5μL混匀后，加入PI 5μL，混匀，室温、避光反应5～15 min，使用流式细胞仪进行检测。

2.3 瑞氏染色 取对数生长期空白组、葛根总黄酮10 g/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组、As2O3组（1μmol/L）、葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组的NB4-R1细胞，1×PBS洗涤后调整密度为1×106/mL，弃上清，加入适量血浆，混匀后推片，晾干。瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态变化，并采集图像。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 收集空白组、葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组、As2O3组（1μmol/L）、葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组、葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组处理48 h的细胞，1×PBS洗涤，调整密度为1×106/mL，75%的冰乙醇（-20℃预冷）固定过夜，染色前用1×PBS洗去固定液，加入PIRnase A染液1 mL，涡旋混匀，室温孵化30 min，用流式细胞仪检测，并分析细胞周期，sub-G1为细胞凋亡群。

2.5 Western blottimg法检测凋亡相关蛋白表达变化 收集空白组、葛根总黄酮10 g/mL组、葛根总黄酮30 g/mL组、葛根总黄酮50 g/mL组处理48 h的细胞，提取细胞蛋白，严格依照BCA蛋白定量试剂盒说明，完成样品的制作与准备，进行蛋白浓度检测。取40μg待测蛋白质样品，行SDS PAGE电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗，4℃过夜，以TBST漂洗后，加入二抗，常温孵育1 h，再经TBST漂洗，最后用显色剂ECL试剂盒显色、曝光、Photoshop6.0软件分析结果。

2.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 25.0软件进行统计，计量资料均以“均数±标准差”（±s）表示，各组数据符合正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组NB4-R1细胞增殖抑制率比较 各组NB4-R1细胞培养24、48、72 h后，与空白组比较，发现其余各组具有不同程度的生长抑制作用，并随着浓度增加、作用时间的延长，抑制率逐渐升高，与葛根总黄酮单用组比较，葛根总黄酮+As2O3组NB-R1细胞活力下降，凋亡更明显，说明葛根总黄酮可呈浓度及时间依赖性抑制细胞的增殖，并与As2O3具有协同作用。（见图1）

图1 各组NB4-R1细胞增殖抑制率比较（±s，n=3）

3.2 各组NB4-R1细胞早期凋亡率比较 葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组NB4-R1细胞处理48 h后细胞早期凋亡率随着浓度增加而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；As2O3组和葛根总黄酮+As2O3组早期凋亡率呈剂量依赖性增加，差异有统计学意义（P<0.05）。（见表1、图2）

表1 各组NB4-R1细胞处理48 h后细胞早期凋亡率比较（±s，n=3）

表1 各组NB4-R1细胞处理48 h后细胞早期凋亡率比较（±s，n=3）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组比较，bP＜0.05；与葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组比较，cP＜0.05

组别 NB4-R1细胞早期凋亡率（%）空白组 1.40±0.20葛根总黄酮10μg/mL组 1.80±0.40葛根总黄酮30μg/mL组 6.70±0.50a葛根总黄酮50μg/mL组 8.30±0.70a As2O3组（1μmol/L） 1.90±0.30葛根总黄酮10μg/mL+As2O3组 4.40±0.46a葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组 7.50±0.65a b葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组 10.90±1.98a b c

图2 各组NB4-R1细胞处理48 h的细胞早期凋亡率

3.3 各组细胞的形态学改变 处理48 h后，在油镜下观察发现未经药物处理的NB4-R1细胞为圆形或椭圆形，细胞膜完整，核浆比高，呈圆形或者椭圆形，边缘多有凹陷或折叠，染色质为紫红色；随着葛根总黄酮浓度增加，细胞发生不同程度的凋亡表现，其中葛根总黄酮30μg/mL+As2O3组和葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组最为显著，多数细胞可观察到典型的细胞凋亡改变，可见细胞形态大小不一，细胞膜破裂，染色质变粗糙，浓缩，部分核仁消失，核浆比变小，染色质固缩、碎裂，并可见凋亡小体形成。（见图3）

图3 各组NB4-R1细胞的形态学改变（瑞氏染色，×1000）

3.4 各组NB4-R1细胞的细胞周期比较 葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）作用后NB4-R1细胞周期发生变化，与空白组比较，葛根总黄酮30μg/mL组S期细胞增多，葛根总黄酮50μg/mL组G1期和S期细胞减少，提示葛根总黄酮能够影响细胞周期进程，使细胞阻滞于S期；葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）+As2O3联合作用后，G1期细胞比例更少，S期细胞比例增加更明显，细胞凋亡比例更大，葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组出现明显亚二倍体细胞，且葛根总黄酮+As2O3联用组较单用葛根总黄酮组凋亡峰更明显。（见图4）

图4 各组NB4-R1细胞的细胞周期比较

3.5 各组NB4-R1细胞凋亡相关蛋白表达比 较 葛根总黄酮50μg/mL组NB4-R1细胞JNK1及JNK2/3蛋白表达高于空白组、葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组（P＜0.05）；葛根总黄酮10μg/mL组、葛根总黄酮30μg/mL组、葛根总黄酮50μg/mL组NB4-R1细胞ERK1/2蛋白表达均低于空白组（P＜0.05），呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图5、表2）

图5 各组NB4-R1细胞凋亡相关蛋白表达情况

表2 各组NB4-R1凋亡相关蛋白表达比较（±s，n=3）

表2 各组NB4-R1凋亡相关蛋白表达比较（±s，n=3）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与葛根总黄酮10μg/mL组比较，bP＜0.05，与葛根总黄酮30μg/mL组比较，cP＜0.05

组别 JNK1/β-actin JNK2/3/β-actin ERK1/2/β-actin空白组 0.22±0.52 0.16±0.06 0.38±0.13葛根总黄酮10μg/mL组 0.23±0.21 0.25±0.04 0.19±0.57a葛根总黄酮30μg/mL组 0.42±0.16 0.34±0.18 0.10±0.47a葛根总黄酮50μg/mL组 0.40±0.05abc 0.41±0.43abc 0.04±0.08abc F 18.099 24.220 59.785 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

4 讨 论

急性早幼粒细胞白血病（APL）是一种特殊类型白血病，具有特征性的t（15、17）染色体和PML/RARa融合基因，出血倾向严重，易并发弥散性血管内凝血（DIC），故早期死亡率高[4]。全反式维甲酸（ATRA）与化疗合理组合可以使得完全缓解率明显提高，可是维甲酸耐药成为ATRA治疗APL的一大缺憾，部分患者对ATRA不敏感，还有部分患者发生高白细胞症和维甲酸综合征，应用As2O3治疗可使对维甲酸耐药或复发患者获得高的完全缓解率，还可以获得分子生物学缓解[5-6]。近几年随着砷剂、苦参碱、冬凌草甲素抗白血病治疗成功的运用，寻找对人体无毒副作用而对肿瘤细胞有高度特异性作用的天然药物研究成为热点。

近年来很多体内外实验发现葛根总黄酮可以不同程度诱导多种白血病细胞株凋亡，已经证实了其抗白血病效应与凋亡通路密切相关，葛根总黄酮处理NB4细胞后，细胞中外源性凋亡通路相关的FasL、Caspases-8蛋白，以及凋亡共同通路Caspase-3蛋白表达均上调，能活化该通路上游调控蛋白JNK、PARP，抑制抗凋亡蛋白激酶p38MAPK。进一步研究发现低剂量葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）和/或联合1μmol/L As2O3能体外诱导NB4细胞凋亡，观察到随着药物浓度的增加，NB4细胞JNK表达逐渐增强。证明两者有协同作用，推测葛根总黄酮可能是通过激活凋亡上游蛋白JNK，进一步激活促凋亡基因表达，激活凋亡信号。

本研究选用葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3处理NB4-R1细胞，光镜、流式细胞仪均观察到明显的细胞凋亡，细胞周期显示葛根总黄酮50μg/mL组G1期细胞比例下降，S期比例增加，尤其是葛根总黄酮50μg/mL+As2O3组细胞亚二倍体比例增加，显示了诱导凋亡作用较强。早期凋亡检测也显示了相近的结果，即葛根总黄酮联合或不联合As2O3对NB4-R1细胞抑制作用呈浓度依赖性，单药组早期凋亡率分别为（1.80±0.40）%、（6.70±0.50）%、（8.30±0.70）%；葛根总黄酮+As2O3联合组早期凋亡率分别为（4.40±0.46）%、（7.50±0.65）%、（10.90±1.98）%，说明了低浓度葛根总黄酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3可以在一定程度上诱导NB4-R1细胞的凋亡，并且两者具有协同作用。

细胞凋亡是区别于细胞坏死的、主动的、受多基因调控的程序化的死亡。在此过程中，细胞发生一系列生化改变，合成某些蛋白质，这些蛋白质的出现，使细胞某些基因开始表达，触发细胞凋亡。为了进一步阐明葛根总黄酮诱导NB4-R1细胞凋亡的上游分子机制，我们选择了与凋亡紧密相关的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）调控系统中的相关分子做了更细致的研究。MAPK系统可以将细胞外信号转导至细胞内或核内，引起诸如细胞增殖、分化、转化及凋亡等生物学事件，目前已经在哺乳动物细胞克隆和鉴定了细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38等3个家族成员。其与细胞凋亡等密切相关[7]。蛋白印迹法发现葛根总黄酮可上调NB4-R1细胞中JNK表达，下调ERK1/2及p38表达。MAPK信号通路是细胞内主要的信号传递途径之一，可调节多种细胞功能如细胞增殖分化、生存、死亡和转化[8-9]。

JNK信号参与调节细胞增殖、凋亡及DNA损伤修复等多个细胞生命过程，通过蛋白激酶间的酶促磷酸化级联反应实现JNK信号通路在多个层面上精密调控细胞间的联系和凋亡[10-11]。研究表明JNK可通过磷酸化c-Jun和活化转录因子2，激活转录因子AP-1，促进细胞凋亡[10]，研究发现随着药物浓度的增加，NB4-R1细胞JNK表达逐渐增强。故推测葛根总黄酮可能是首先通过激活凋亡上游蛋白JNK，进一步激活促凋亡基因表达，激活凋亡信号，与文献报道一致。

ERK1/2为细胞外信号调节激酶，又称p44/42丝裂原活化蛋白激酶，为信号转导的重要分子[12]，在恶性肿瘤细胞中，由于各种机制导致ERK过度活化，促进细胞增殖、抑制凋亡、促进细胞侵袭，影响细胞分化[13]。ERK能够调控细胞增殖：细胞周期素D1是细胞周期G1/S调控点关键分子，其转录依赖于ERK的持续激活和核内滞留[14]。推测本实验中ERK表达的下调可能引起NB4-R1细胞周期信号转导通路发生改变，使NB4-R1细胞不能通过限制点，停滞于细胞周期进程，停止恶性增殖。

研究发现ERK的表达随着药物浓度增加，表达逐渐减弱，说明ERK并不是c-Jun的激酶，也不是死亡介导的蛋白，反而作为一个存活相关因子存在。有研究探讨了番荔枝内酯化合物squamocin诱导白血病HL-60细胞凋亡的作用，发现药物作用后细胞生长明显受到抑制，磷酸化P44/42MAPK的蛋白量明显减少[15]。研究结果与本实验研究结果一致。ERK1/2对细胞凋亡的影响机制非常复杂，一方面可诱导编码凋亡抑制蛋白基因的表达，诱导抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的表达，还可以通过降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，以及促进Bad、Bim降解，发挥抗凋亡作用。活化的ERK可在不同的微环境中发挥不同的作用，这可能是与其他通路共同作用、相互影响的结果[16-17]。

细胞的凋亡是一个复杂的过程，具有多样性，细胞生存的微环境与细胞通路作用密切相关，即使同一信号通路对不同物种的细胞微环境及敏感度亦非完全相同，不同应激、不同细胞存在不同的信号转导途径，并且和其他通路可能相互串联，从而发挥不同的生物学效应。本实验中葛根总黄酮能够同时调控凋亡相关通路MAPKs家族中的多个成员，推测葛根总黄酮诱导NB4-R1细胞凋亡可能存在多个靶点，可能激活细胞凋亡途径中多个分子，或者此过程存在JNK、ERK两个通路之间的交叉串联，研究这一过程中相关分子信号的变化对细胞的恶化及药物作用靶点具有重要意义，但机制复杂，仍需进一步研究。