马鞭草苷通过NF-κB/MAPK信号通路干预支气管哮喘大鼠气道炎症、气道平滑肌细胞增殖及RhoA表达的研究*

董淑敏，高鹏辉，梁文华

（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 266000；2.青岛海慈医疗集团，山东 青岛 266000）

支气管哮喘是一种常见的慢性炎症性呼吸系统疾病，不可逆性气流受阻、气道高反应性、气道慢性炎症是该病的主要特征[1]。现代医学认为支气管哮喘的发生与炎症细胞浸润密切关联，NF-κB/MAPK信号通路介导炎症反应，在气道及肺组织损伤中起到重要作用[2]，控制机体的炎症反应成为治疗支气管哮喘的重要途径。西医在控制感染与炎症治疗方面具有较好的疗效，临床上通常采用糖皮质激素缓解患者气道炎症症状，并抑制气道平滑肌细胞增殖，从而起到治疗疾病的效果[3]。但西药治疗通常仅局限于对症治疗，且长期药物治疗可导致患者出现各种不良反应。当前，中医“清热化痰”法被广泛应用于气道炎症疾病的临床治疗之中，且取得了较好的成效，但其具体作用机制尚不明确。马鞭草苷是马鞭草的主要活性成分，具有镇咳、抗炎之效。本研究通过观察马鞭草苷对支气管哮喘大鼠气道炎症、气道平滑肌细胞增殖、RhoA表达的影响，旨在探究其治疗哮喘的实际作用机制，为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄健康雄性SPF级SD大鼠72只，体质量240~260 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物使用许可证号：SYXK（川）2014-189。在室温25~27℃、相对湿度50%环境中适应性饲养1周。本次研究经医学实验动物管理委员会批准同意进行。

1.2 药物与试剂 卵清白蛋白（美国Sigma，批号：20180910）；氢氧化铝（淄博化学试剂公司，批号：20181106）；NF-κBp65试剂盒（货号：SBJ_M0313）、p-NF-κBp65试剂盒（货号：SBJ_M0314）、p-IκBα试剂盒（货号：SBJ-R0176）、ERK1/2试剂盒（货号：SBJ-M0326）、JNK试剂盒（货号：SBJ-R0160）、p38MAPK试剂盒（货号：SBJ-R0189）、p-ERK1/2试剂盒（货号：SBJ-M0327）、p-JNK试剂盒（货号：SBJ-R0161）、p-p38MAPK试剂盒（货号：SBJ-R0190）（南京森贝伽生物科技有限公司）；马鞭草苷（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：20181122）；临床上马鞭草苷常用日用剂量为3 mg/kg，按照以下公式换算，drat=dhuman×0.71/0.11，大鼠日用剂量为19.36 mg/kg，考虑到大鼠药物耐受量比人类更高，故马鞭草苷高、中、低剂量组剂量分别为80、40、20 mg/kg。

1.3 主要仪器HT2型酶联免疫检测仪（奥地利Anthos公司）；MK3型多功能酶标仪（芬兰Therm公司）；EPS-600型电泳仪（上海天能科技有限公司）；Trans-Blot SD型Western blotting转膜仪（BioRad公司）。

1.4 造模与分组将72只健康SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组和马鞭草苷高、中、低剂量组，每组12只。采用卵清白蛋白致敏法制备支气管哮喘大鼠模型。各组大鼠（除对照组）在第1天腹腔注射1 mL抗原液（10 mg卵清白蛋白+100 mg氢氧化铝凝胶+5×109菌株百日咳杆菌疫苗）致敏，并在第8天重复上述步骤加强致敏。第15天开始，每天将大鼠放入密闭玻璃罩内，采用1%卵清白蛋白生理盐水雾化激发30 min。大鼠出现张口呼吸、点头呼吸、腹式呼吸、焦躁不安、皮肤瘙痒、动作迟钝等症状说明造模成功[4]。

1.5 实验给药剔除造模失败大鼠，各组均保留10只建模成功大鼠进行后续实验研究。每次雾化吸入前对大鼠进行药物灌胃治疗，马鞭草苷高、中、低剂量组剂量分别为80、40、20 mg/kg，地塞米松组剂量为1.5 mg/kg，对照组与模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续治疗1周。

1.6 取材末次雾化吸入24 h后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠。开胸使双肺与气管充分暴露，分离肺组织，并结扎右主支气管。针头于气管插入，注入4 mL生理盐水灌洗并立即回抽，灌洗3次后收集支气管灌洗液。4℃2 000 r/min离心5 min后，取上清液保存于-20℃冰箱内备用。剪取右下肺组织采用4%多聚甲醛缓冲液固定，石蜡包埋切片后用苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察大鼠肺组织病理学变化情况。剪取大鼠右上肺保存于-80℃液氮中备用[5]。

1.7 观察指标

1.7.1 大鼠支气管灌洗液中炎症细胞计数取支气管灌洗液离心后的沉淀，加入10%小牛血清-PBS缓冲液100μL重悬，取0.1 mL滴加到细胞计数板内，2 min后进行白细胞计数。取0.01 mL重悬液进行涂片，瑞氏染色后测定巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞百分比。

1.7.2大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖情况检测参考JOHNSON等[6]的方法培养大鼠ASMCs，无血清DMEM培养2~5代细胞，使其同步于G0期。之后采用含10%FBS的DMEM培养24 h。采用PBS缓冲液将收集的ASMCs配制为1×106个/mL的细胞悬液并用乙醇固定，加入碘化丙啶、RNA酶后，采用流式细胞仪检测细胞增殖情况，并通过配套软件检测各期细胞占比情况[7]。ASMCs培养结束时，在96孔板内加入20μL MTT（5mg/mL），4 h后去培养液加入150μL二甲基亚砜，振荡30 min，检测各孔450 nm处的吸光度（A值）。

1.7.3 大鼠肺组织RhoA表达水平检测通过SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法制备RhoA、GAPDH标准曲线，通过标准曲线进行定量。通过TRIzol法提取RNA，逆转录后进行PCR扩增。RhoA上 游5＇AACTGGTGATTGTTGGTG3＇，下 游5＇CTGCCACATAGTTTTCAA3＇，114 bp。GAPDH上游5＇GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3＇，下游5＇ATGGTGGTGAAGACGCCAGT3＇，142 bp。反应条件：变性95℃30 s，退火95℃5 s，延伸60℃34 s，循环40次。由荧光定量PCR仪分析计算结果，通过2-△△Ct法得相对表达比率。采用Western blotting法检测大鼠肺组织RhoA表达水平，取出备用标本，剪碎后消化处理，裂解离心提取蛋白质。采用缓冲液稀释后取50μL样本加入上样孔，电泳后转印至硝酸纤维素膜。TBS封闭过夜，次日TBS洗膜，加入1∶400一抗室温孵育2 h，加入（1∶2 000）二抗室温孵育2 h，清洗后采用凝胶成像分析软件分析检测电泳条带的灰度值[8]。

1.7.4 大鼠NF-κB、MAPK信号通路活性检测 取出大鼠右肺组织，加入4℃生理盐水研磨成组织匀浆。2 500 r/min离心10 min，取上清液。通过ELISA法检测各组大鼠NF-κB信号通路NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα与MAPK信号通路ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK表达水平，评估马鞭草苷对支气管哮喘大鼠NF-κB/MAPK信号通路活性的影响。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠支气管灌洗液中炎症细胞计数结果比较 模型组大鼠支气管灌洗液中巨噬细胞百分比明显低于对照组（P<0.05），淋巴细胞、中性粒细胞百分比和白细胞计数明显高于对照组（P<0.01）；地塞米松组和马鞭草苷高、中、低剂量组大鼠支气管灌洗液中淋巴细胞、中性粒细胞百分比和白细胞计数明显低于模型组（P<0.05或P<0.01），巨噬细胞百分比明显高于模型组（P<0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠支气管灌洗液中炎症细胞计数结果比较（±s）

表1 各组大鼠支气管灌洗液中炎症细胞计数结果比较（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg） 巨噬细胞（%） 淋巴细胞（%）中性粒细胞（%）白细胞计数（×107/L）对照组 10 - 92.63±4.52 5.81±2.76 1.51±1.04 1.88±1.02模型组 10 - 69.71±10.45a 8.14±2.46b 22.13±5.14b 10.16±4.63b马鞭草苷高剂量组 10 80 94.92±4.06c 3.11±1.18c 1.88±1.03d 2.17±1.24d马鞭草苷中剂量组 10 40 90.38±3.92c 4.21±1.26c 5.35±1.37d 3.28±1.36d马鞭草苷低剂量组 10 20 85.36±4.31c 5.18±1.87c 9.46±2.17c 5.20±2.33c地塞米松组 10 1.5 86.74±3.22c 4.39±1.92c 8.94±2.03c 5.12±2.46c

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化情况比较 对照组大鼠肺组织形态正常，肺泡轮廓清晰，无炎症细胞浸润表现；模型组大鼠肺组织可见肺泡破坏程度较为严重，部分肺泡扩张，出现水肿、增厚等改变，炎症细胞浸润较为明显；马鞭草苷高、中、低剂量组与地塞米松组大鼠均有气道上皮细胞破坏、炎症细胞浸润等改变，但损伤程度明显低于模型组。（见图1）

图1 各组大鼠肺组织病理切片图（HE，×200，标尺=20μm）

2.3 各组大鼠ASMCs增殖情况比较 与对照组比较，模型组大鼠G0/G1期细胞占比明显降低，S期细胞占比明显升高（P<0.05），A450值明显增加（P<0.01）；与模型组比较，马鞭草苷各剂量组和地塞米松组大鼠S期细胞占比明显降低，G0/G1期细胞占比相对升高（P<0.05或P<0.01），A450值明显降低（P<0.05或P<0.01）。（见表2）

表2 各组大鼠ASMCs增殖情况比较（±s）

表2 各组大鼠ASMCs增殖情况比较（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

各期细胞占比（%）G0/G1期 S期对照组 10 - 78.52±6.64 12.03±2.84 0.14±0.37模型组 10 - 64.86±4.85a 22.18±3.66a 0.76±0.95b马鞭草苷高剂量组 10 80 85.32±8.69c 9.68±2.47d 0.21±0.79d马鞭草苷中剂量组 10 40 81.64±7.37c 11.73±3.36c 0.34±0.71c马鞭草苷低剂量组 10 20 76.48±6.24c 14.59±3.48c 0.44±0.43c地塞米松组 10 1.5 79.54±7.16c 12.85±3.16c 0.36±0.68c组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg）A450值

2.4 各组大鼠肺组织中RhoA mRNA表达及RhoA蛋白表达比较 模型组大鼠肺组织中RhoA mRNA表达及RhoA蛋白表达均明显高于对照组（P<0.05或P<0.01）；马鞭草苷各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织中RhoA mRNA表达及RhoA蛋白表达均明显低于模型组（P<0.05或P<0.01）。（见图2、表3）

表3 各组大鼠肺组织中RhoA mRNA表达及RhoA蛋白表达灰度比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织中RhoA mRNA表达及RhoA蛋白表达灰度比较（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）RhoA mRNA表达RhoA蛋白表达灰度对照组 10 - 1.00±0.00 0.24±0.06模型组 10 - 2.21±0.11a 0.73±0.05b马鞭草苷高剂量组10 80 1.25±0.58c 0.29±0.06d马鞭草苷中剂量组10 40 1.36±0.34c 0.38±0.05c马鞭草苷低剂量组10 20 1.72±0.12c 0.57±0.04c地塞米松组 10 1.5 1.44±0.09c 0.44±0.06c

图2 各组大鼠肺组织中RhoA蛋白表达情况

2.5 各组大鼠肺组织NF-κB信号通路活性比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，马鞭草苷各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。（见表4）

表4 各组大鼠肺组织NF-κB信号通路活性比较（±s，ng/L）

表4 各组大鼠肺组织NF-κB信号通路活性比较（±s，ng/L）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）NF-κBp65 p-NF-κBp65 p-IκBα对照组 10 - 39.54±5.18 13.82±2.12 11.15±2.03模型组 10 - 82.11±11.23b 43.28±5.31b 33.74±5.42a马鞭草苷高剂量组10 80 43.58±6.45d 15.76±3.87c 14.65±3.47c马鞭草苷中剂量组10 40 59.13±7.08c 22.54±4.32c 20.78±3.48c马鞭草苷低剂量组10 20 68.64±8.62c 31.53±4.48c 26.86±4.43c地塞米松组 10 1.5 61.28±7.36c 24.82±4.56c 23.56±3.25c

2.6 各组大鼠肺组织MAPK信号通路活性比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，马鞭草苷各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。（见表5）

表5 各组大鼠肺MAPK信号通路活性比较（±s，ng/L）

表5 各组大鼠肺MAPK信号通路活性比较（±s，ng/L）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）ERK1/2 JNK p38MAPK p-ERK1/2 p-JNK p-p38MAPK对照组 10 - 33.02±5.18 40.18±5.84 52.72±7.48 8.37±1.59 11.95±2.36 14.70±2.84模型组 10 - 54.79±6.85a 75.93±9.46a 95.62±9.84b 26.72±3.13b 36.42±4.89a 50.16±7.25a马鞭草苷高剂量组 10 80 36.84±5.27c 43.26±6.04d 58.37±8.14d 11.35±1.62d 14.69±2.87c 18.58±5.93c马鞭草苷中剂量组 10 40 43.49±5.37c 56.81±7.35c 70.43±8.40c 15.37±2.68c 21.48±3.12c 30.71±5.86c马鞭草苷低剂量组 10 20 48.37±5.89 63.59±7.62c 78.94±8.63c 20.59±2.84c 26.63±3.85c 36.87±6.43c地塞米松组 10 1.5 46.56±6.14c 59.75±8.42c 72.68±8.72c 18.63±2.76c 24.69±3.46c 32.84±5.92c

3 讨 论

气道是呼吸系统抵御外界有害刺激的第一道防线，甲醛、烟雾等有害因素均可对气道及肺组织造成损伤。气道损伤发生后机体会进行再生与修复，修复完成后各种炎症及细胞增殖便会得到有效抑制。支气管哮喘是由免疫细胞因子及炎症介质诱发的特异性炎症性疾病，NF-κBp65与p38MAPK是发病与疾病进展的重要转导机制。NF-κB是细胞内信号转导的重要转录因子，通常情况下，由于IκB的抑制作用NF-κB在细胞质中处于非活性形态[9]。一旦IκB磷酸化NF-κB受到的抑制解除，NF-κB二聚体暴露出核定位序列（NLS），NF-κB会转移至细胞核内与目的基因发生特异性结合，促进IL-5、IL-13等炎症因子的基因转录，继而提高炎症因子的表达水平，促进支气管哮喘的疾病进展[10]。MAPK是广泛存在于细胞内的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，可以将细胞质信号传递给细胞核并使之发生相应变化。MAPK信号通路包括p38MAPK、JNK、ERK1/2介导的级联反应，细胞因子、高渗状态、紫外线照射等细胞外信号均能激活MAPK信号通路，其能够调控下游转录因子，并参与细胞生长、分化、凋亡、存活及各种炎症反应，其活性增加可促进机体产生炎症因子，扩大炎症反应[11]。

ASMCs异常增殖是导致气道重塑的一项重要原因，ASMCs过度增殖不仅会导致气道狭窄、气道管壁加厚，同时还会产生大量炎性细胞因子与趋化因子，加重机体的炎症反应[12]。ASMCs增殖与细胞周期进展有着密切关联，G1/S期与G2/M期是细胞周期的限制点，细胞在G1期对外界信号做出反应，若越过G1/S期这一限制点，细胞周期便可自主进行[13]。可见阻断细胞完成正常的分裂周期有助于控制哮喘疾病进展，可以在一定程度上起到延缓甚至逆转气道重构的效果。Rho/Rock信号通路可以介导多种生物学行为，Rho蛋白是Ras超家族中的G蛋白成员，具有GTP酶活性。通常情况下以非活化Rho-GDP与活化Rho-GTP形式存在，活性RhoA可以使平滑肌发生收缩，从而影响细胞骨架的形态与结构[14]。Rock以Rokβ/Rockl和Roka/Rock2的形式存在于心、肝、肺等组织中，是Rho激酶下游靶效应分子。许多炎症因子均能使Rho活化，ROCK与Rho通过磷酸化激活核因子与下游蛋白，完成肌动蛋白纤维与细胞骨架的组装[15]。POSSA S S等[16]研究指出抑制Rho/Rock信号通路可以有效抑制5-HT诱导的大鼠ASMC过度增殖，使细胞周期停留在G0/G1期。此外，抑制Rho激酶活性还能减轻机体氧化应激反应，改善炎症并延缓气道重塑进程。可见Rho/Rock信号通路与ASMCs增殖、炎症细胞迁移、哮喘疾病进展都具有密切关联。

糖皮质激素是当前治疗哮喘的一线药物，其主要通过抑制气道炎症与ASMCs过度增殖，从而改善患者的疾病症状。但糖皮质激素治疗不具备特异性，长期治疗可能导致内分泌、代谢紊乱。马鞭草苷是马鞭草中的极性成分，属于环烯醚萜苷类物质，具有保护心脏、促进血管新生等生物活性[17]。朱颖涛等[18]研究表明马鞭草苷可以降低BALF中TNF-α、IL-4、IL-5等炎症因子水平，并下调淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比。同时降低大鼠肺泡间质炎性细胞浸润程度，抑制ASMC过度增殖分化。司晓丽等[19]采用百合知母汤干预支气管哮喘大鼠，光镜检查结果显示大鼠肺组织可见少量炎症细胞浸润，且血浆中IL-2水平升高，IL-4水平降低，G0/G1期细胞占比提升，G2/M期与S期细胞占比减少，表明百合知母汤可以有效抑制外周淋巴细胞CaN活性，抑制淋巴细胞过度增殖，从而改善大鼠气道炎症。陈宏等[20]研究表明补益肺肾汤可以下调支气管哮喘大鼠NF-κB、IL-2、IL-4、IL-5等炎症因子水平，减轻气道炎症反应，改善大鼠预后情况。本次研究发现马鞭草苷低、中、高剂量组白细胞计数和淋巴细胞、中性粒细胞百分比明显低于模型组（P<0.05），巨噬细胞百分比明显高于模型组（P<0.05），提示马鞭草苷可以显著改善支气管哮喘大鼠气道炎症，降低机体的炎症反应。对比各组大鼠肺组织病理变化情况可知，马鞭草苷低、中、高剂量组大鼠肺泡受损程度较模型组明显减轻，炎症细胞浸润程度明显下降。模型组大鼠G0/G1期细胞占比明显下降，S期细胞占比升高，提示ASMC增殖异常。马鞭草苷低、中、高剂量组大鼠S期细胞占比明显降低，提示ASMC增殖异常得到有效控制，大鼠哮喘疾病进程明显延缓。观察各组大鼠RhoA表达及NF-κB、MAPK信号通路活性可知，哮喘大鼠RhoA表达及NF-κB、MAPK信号通路活性均明显升高。RhoA为NF-κB的上游基因，两者表达水平呈正相关提示在支气管哮喘发展过程中RhoA/Rho信号通路可能通过级联反应激活下游NF-κB因子，促进机体产生大量炎症因子，扩大机体的炎症反应，加重疾病症状。马鞭草苷可以有效抑制RhoA表达，并下调NF-κB、MAPK信号通路活性，抑制炎症因子释放并阻止ASMCs增殖，从而改善大鼠的气道炎症，缓解疾病症状。本次研究表明，不同剂量马鞭草苷对支气管哮喘大鼠的疗效不尽相同，表现出一定的剂量依赖性，即马鞭草苷剂量越高，对哮喘的治疗效果越好。地塞米松的疗效基本位于低、中剂量马鞭草苷之间，提示中、高剂量马鞭草苷对支气管哮喘大鼠具有较好的治疗效果。

综上所述，马鞭草苷可以有效减轻支气管哮喘大鼠的气道炎症，抑制ASMC过度增殖与RhoA表达，从而改善大鼠的疾病症状，逆转气道重塑进程。其作用机制可能在于抑制NF-κB、MAPK信号通路活性，降低机体的炎症反应。