注射用丹参多酚酸盐对动脉粥样硬化大鼠的作用和机制探讨*

陈 丽，蔡惠铃，李影雄，孟泳铮，李敏霞

（1.佛山市中医院，广东 佛山 528000；2.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510102）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种全身性慢性疾病，是冠心病、缺血性脑卒中等多种心脑血管疾病最重要的病理基础，最终致死率和致残率非常高[1]。流行病学调查显示，冠心病、脑卒中等动脉粥样硬化性疾病是我国居民致死的首要原因，严重威胁我国居民的健康，降低生活质量[2]。而且随着生活方式的改变和老龄人口的剧增，AS的发病率明显上升并且趋于年轻化。脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化损伤、细胞外基质降解等均是导致AS发生发展的核心机制[3]。AS属于中医学“胸痹”“脉痹”“中风”等范畴，其核心病机为瘀血痹阻。注射用丹参多酚酸盐由丹参提取而成，具有活血、化瘀、通脉等功效，本课题组临床研究发现注射用丹参多酚酸盐可以降低冠心病、脑卒中患者颈动脉斑块厚度，缩小斑块面积，但其机制仍未阐明。因此，本实验复制了AS大鼠模型，并给予注射用丹参多酚酸盐干预，观察其对AS大鼠斑块、血脂、炎症、氧化损伤、细胞外基质等的影响，初步探讨其防治AS的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄SPF级雄性SD大鼠43只，体质量（200±10）g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2019-0035；饲养环境为温度（22±2）℃，湿度50%~60%，12 h明暗交替。实验过程中采用过量麻醉法处死。高脂饲料配方：基础饲料81.3%、猪油10%、蔗糖5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、胆酸钠0.5%、胆固醇3%；基础饲料和高脂饲料委托广东省医学实验动物中心进行加工。本实验通过佛山市中医院医学实验动物伦理委员会的批准。

1.2 药物与试剂 注射用丹参多酚酸盐（上海绿谷制药有限公司，批号：20190113，规格：100 mg/瓶）；阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号：20181215，规格：10 mg/片）；血脂试剂盒[总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒（货号：HL20142）、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒（货号：HL20195）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒（货号：HL20197）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒（货号：HL20196）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）试剂盒（货号：HL10046）]（上海哈灵生物科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（货号：ER1393）、白介素-1β（IL-1β）试剂盒（货号：ER1094）、白介素-6（IL-6）试剂盒（货号：ER1105）、白介素-10（IL-10）试剂盒（货号：ER0033）（武汉菲恩生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（货号：GD-AW1922）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（货号：GD-JG0454-E）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号：GD-S1921-A）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）试剂盒（货号：GD-DS1710）、血管细胞黏附分子-1（Vascular Cell Adhesion Molecule-1，VCAM-1）试剂盒（货号：GD-DX1591）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）试剂盒（上海古朵生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器TGL-15M台式微量高速冷冻离心机（湖南平凡科技有限公司）；AU5800全自动生化分析仪（贝克曼库尔特商贸中国有限公司）；HBS-1096C酶标分析仪（南京德铁实验设备有限公司）；Tissuelyser-24冷冻液氮低温研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

1.4 造模与分组43只大鼠进行适应性喂养7 d，随机取10只作为对照组。其余33只大鼠参照文献[4]建立AS大鼠模型，造模第1天一次性腹腔注射维生素D3 60万U/kg，并且给予高脂饲料喂养（20 g/d）；对照组大鼠一次性腹腔注射等体积的生理盐水，并且给予基础饲料喂养（20 g/d），造模时间为8周。AS模型成功的标准[5]：主动脉见斑块形成。8周后，27只大鼠造模成功，造模成功率为81.82%（27/33）。随后将成模27只大鼠随机分为模型组、丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组，每组9只。

1.5 实验给药 按照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”，丹参多酚酸盐组大鼠予以注射用丹参多酚酸盐腹腔注射，20 mg/（kg·d）；阿托伐他汀组大鼠灌胃给予阿托伐他汀钙片溶液，2 mg/（kg·d），对照组和模型组大鼠予以等体积的生理盐水腹腔注射，连续给药4周。4周后处死大鼠，取材并进行相关指标检测。

1.6 观察指标

1.6.1 血清指标 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剖开腹腔，腹主动脉取血，离心后取血清，采用全自动生化检测仪检测大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，ELISA法检测血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，光度法测定血清SOD、GSH-Px、MDA含量。

1.6.2 主动脉病理变化 处死大鼠，取主动脉，生理盐水冲洗后4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下观察主动脉病理变化。

1.6.3 主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量 取适量大鼠主动脉组织，PBS反复清洗去除血液，称重，将主动脉和PBS加入匀浆器后充分研磨，再利用超声破碎。匀浆液经5 000 g离心5 min后取上清液，采用ELISA法检测MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计处理，计量资料用“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法检验，以P<0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠主动脉病理变化 对照组大鼠主动脉内膜、中膜、外膜均未见增生、肥厚；模型组大鼠主动脉中膜平滑肌细胞明显增生，血管壁明显增厚，大量泡沫细胞聚集，形成一动脉粥样硬化斑块；丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组大鼠主动脉中膜轻微增生，无动脉粥样硬化斑块形成。（见图1）

图1 各组大鼠主动脉病理变化（HE，×200，标尺=100μm）

2.2 各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明显升高（P<0.05），HDL-C含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明显降低（P<0.05），HDL-C含量明显升高（P<0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比较（±s，n=9）

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显升高（P<0.05），IL-10含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显降低（P<0.05），IL-10含量明显升高（P<0.05）。（见图3）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图3各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比较（±s，n=9）

2.4 各组大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清MDA含量明显升高（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组大鼠血清MDA含量明显降低（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明显升高（P<0.05）。（见图4）

图4 各组大鼠SOD、GSH-Px、MDA含量比较（±s，n=9）

2.5 各组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比较 与对照组比较，模型组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和阿托伐他汀组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明显降低（P<0.05）。（见图5）

图5 各组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比较（±s，n=9）

3 讨 论

中医学无AS之病名，根据其临床表现，可归属于中医学“胸痹”“脉痹”“中风”等范畴，中医学认为其核心病机为瘀血痹阻，气为血之帅，血为气之母，气血失和，或气虚而滞，或气郁而滞，均可引起血流不畅，瘀血内生，痹阻血脉，化生斑块[6-8]。痰浊、寒凝、水湿等均可以导致血运不畅，滞而成瘀，痹阻血脉，化生斑块。因此，治疗上应以活血化瘀为大法。注射用丹参多酚酸盐是由丹参经提取的多酚酸盐化合物组成，丹参味苦，性微寒，归心、肝经，具有活血化瘀、通络止痛等功效。注射用丹参多酚酸盐具有活血、祛瘀、通络功效。现代药理研究表明，注射用丹参多酚酸盐具有抗氧化损伤、抑制炎症等作用[9]。

动脉粥样硬化机制尚未完全阐明，脂质代谢紊乱、炎症反应、氧化损伤、细胞外基质降解等在动脉粥样硬化的发生发展中均起到重要的作用。脂质代谢紊乱是导致AS的最重要病理基础，血液中TG、TC、LDL-C含量升高可以导致血管内皮损伤，引发血管内皮功能障碍，单核细胞通过破损的血管内皮进入内膜间隙，并吞噬ox-LDL形成泡沫细胞。泡沫细胞可以刺激生长因子释放，进而促进血管平滑肌增殖，血管壁肥厚，形成脂质条纹并进展为动脉粥样硬化斑块[10-11]。HDL-C可以通过促进胆固醇运载至外周组织细胞，从而减少脂质沉积于血管内膜[12]。因此，调节脂质代谢是防治AS的关键。本研究结果发现，AS模型组大鼠主动脉斑块形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明显升高，HDL-C含量明显降低；而丹参多酚酸盐组大鼠主动脉无斑块形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明显降低，HDL-C含量明显升高。因此，注射用丹参多酚酸盐具有抑制和减缓动脉粥样硬化斑块形成的作用，可能是通过调节脂质代谢途径实现。

有学者提出动脉粥样硬化属于一种慢性低度炎症性反应。在AS形成过程中，平滑肌细胞、巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，导致机体处于一种慢性低度炎症反应状态。TNF-α可以增加血管内皮的通透性，从而促使LDL-C进入血管内皮细胞进而形成泡沫细胞[13-14]。而且TNF-α还可以刺激IL-1β、IL-6释放，加重血管炎症反应[15]。IL-1β可以通过促进黏附因子表达和内皮细胞增殖介导AS形成[16]。IL-6可以加强局部炎症反应，促进黏附因子的表达，促进单核细胞和巨噬细胞迁移，促进血管内皮平滑肌细胞增殖，从而导致斑块形成，并可以导致斑块不稳定[17]。IL-10是一种强效抑炎因子，可以抑制炎症因子的生成和释放，抑制平滑肌细胞增殖，减缓动脉粥样硬化。因此，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表达和促进IL-10的表达可以改善动脉粥样硬化。氧自由基可以损伤血管内皮细胞，促进脂质和单核细胞进入血管内膜下，导致斑块形成[18-19]。而机体内的抗氧化酶可以清除氧自由基，减轻氧化损伤。SOD、GSH-Px是机体内的主要抗氧化酶，可以清除氧自由基。MDA是机体内的氧化代谢产物，反映机体氧化损伤的严重程度。SOD、GSH-Px、MDA是反映机体氧化损伤的重要标志物。本研究结果发现，AS模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明显升高，IL-10、SOD、GSH-Px含量明显降低；而丹参多酚酸盐组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明显降低，IL-10、SOD、GSH-Px含量明显升高。说明注射用丹参多酚酸盐可以通过下调TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA的表达，上调IL-10、SOD、GSH-Px的表达，抑制炎症反应和抗氧化损伤从而抑制和减缓AS的形成。

VCAM-1是一种由内皮细胞表达的糖蛋白，可以促进单核巨噬细胞、中性粒细胞等黏附在破损血管内壁，迁移至血管内膜后形成泡沫细胞，介导AS进展[20]。MCP-1可以趋化单核细胞和淋巴细胞迁移至血管内膜下，趋化炎性细胞聚集，介导斑块形成。细胞外基质是血管壁的重要组成部分，其降解和重塑参与了AS的发生发展[21]。MMP-9可以降解细胞外基质，导致斑块不稳定和斑块形成。本研究结果发现，AS模型组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明显升高；而丹参多酚酸盐组大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明显降低。说明注射用丹参多酚酸盐可以通过抑制MCP-1、VCAM-1、MMP-9的表达而抑制AS的形成。

综上所述，注射用丹参多酚酸盐可以通过调节脂代谢，抑制炎症和抗氧化损伤改善动脉粥样硬化。