补肾活血方冻干粉对低氧诱导HTR-8/SVneo滋养细胞HIF-1α及VEGFA表达的影响*

张 婕，倪 爽，李 佶

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续发生两次或两次以上的自然流产，近年有逐渐上升趋势，发生率为1%~5%，是妇产科中较难处理的疾病，直接影响患者的生殖健康[1]。RSA的发病原因复杂，与偶发性流产基本一致，但各种原因所占的比例有所不同，包括染色体异常、解剖结构因素、感染因素、内分泌因素、免疫因素、血栓前状态等其他因素，其确切机制尚不明确[2]。RSA属中医学“滑胎”“屡孕屡堕”或“数堕胎”范畴，具有反复发作、胚胎应期而堕的特点。滑胎多为虚证，但可兼夹瘀、热，辨证着重于脏腑、气血之辨。李佶经过长期临床实践，从“肾”“瘀”论治，病证结合，中西贯通，自拟补肾活血方治疗RSA，临床收效颇佳[3]。在妊娠早期，胎盘绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宫蜕膜层和肌层血管侵入和分化，重塑螺旋动脉，建立母—胎循环。RSA多发生在妊娠早期，人类早期的胚胎发育处在一个相对低氧的微环境中，维持正常情况下妊娠早期胎盘中这种生理性低氧环境对调节滋养层功能和胎盘早期发育至关重要[4]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧诱导因子家族中受到氧浓度调节的主要因子，血管生成是影响胎儿和胎盘发育的重要因素，依赖于多种生长因子（包括血管内皮生长因子及其受体）和多种信号传导途径[5]。本实验基于临床疗效及前期研究基础，通过使用化学低氧诱导剂氯化钴（CoCl2）建立滋养细胞低氧模型，探索补肾活血方冻干粉对HTR-8/SVneo滋养细胞小管形成、HIF-1α和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）表达的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 人绒毛膜滋养层细胞株HTR-8/SVneo由上海交通大学附属国际和平妇幼保健院惠赠。

1.2 药物与试剂 补肾活血方药物组成：菟丝子15 g，杜仲15 g，续断15 g，桑寄生15 g，当归6 g，川芎9 g等，所有药材由上海中医药大学附属龙华医院提供。将中药复方放入煎药壶中，加入1 000 mL的纯净水，浸泡后加热煎药，共煎2次后将水煎液混合，4层纱布过滤后旋转蒸发仪浓缩；后将药液倒于器皿中放置于冷冻干燥机的物料托盘中，-50℃预冻5 h，再抽真空干燥；干燥机升温，最后固定到-40℃冻干72 h，制成含生药量145 g/L的冻干粉，-20℃冰箱保存备用。补肾活血方冻干粉溶液母液用一级纯水配制，浓度为0.1 g/mL，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌。临用时以含10%胎牛血清的培养基稀释成所需浓度。

DMEM/F12培养基（批号：11320033）、胎牛血清（批号：1997802C）、胰酶（批号：25200072）（美国Gibco公司）；氯化钴（Sigma公司，批号：1002965958）；二甲基亚砜（北京鼎国昌盛生物技术公司，批号：DH105-10）；一抗HIF-1α（批号：ab1）、VEGFA（批号：ab52917）（Abcam公司）；GAPDH（CST公司，批号：14C10）；二抗Anti-rabbit IgG（批号：A0208）、Anti-mouse IgG（批号：A0216）、Beyo ECL Plus（批号：P0018S）（碧云天生物技术有限公司）；Matrigel基质胶（美国Corning公司，批号：356234）；逆转录试剂盒（批号：RR037A）、Real-time PCR试剂盒（批号：RR420A）（TaKaRa公司）。PCR引物序列由上海生工生物有限公司设计合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3 主要仪器BSA124S型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Ti-E型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；YZB/USA1802-2009型恒温培养箱（美国Thermo公司）；5424R型低温台式离心机（德国Eppendorf公司）；Synergy H1MF型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Cemiscope6300型凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；XSP-3C型显微镜（上海民怡仪器仪表有限公司）；MINI Protein V3型电泳仪、Mini Trans Blot型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；ProFlex PCR型基因扩增仪（美国Life teconology）；ABI7500型实时荧光定量PCR仪（美国Life teconology）。

1.4 细胞培养 将HTR-8/SVneo滋养细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，每2 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.5 细胞分组与干预HTR-8/SVneo细胞随机分为空白组、低氧模型组、补肾活血方冻干粉低剂量组、补肾活血方冻干粉中剂量组、补肾活血方冻干粉高剂量组。根据前期MTT实验结果筛选补肾活血方安全有效剂量即补肾活血方冻干粉终浓度5、10、25 mg/L。除空白组外，其余各组均给予CoCl2（100μmol/L）诱导低氧造模[6]，中药组分别再同时给予不同浓度的补肾活血方冻干粉溶液。细胞培养48 h后收集用于后续实验。

1.6 检测指标

1.6.1 Tube formation法检测血管生成 将细胞外基质胶Matrigel充分溶解，用基础培养基1∶2稀释后以150μL/孔铺于24孔板中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h使其凝固成胶。分别收集空白组、低氧模型组和补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组的细胞，1 500 r/min离心5 min，用含1%FBS的培养基调整细胞浓度为2×105个/mL。向铺好胶的24孔板中每孔加入上述细胞悬液500μL，37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育8 h，每组设3个复孔。倒置显微镜下观察各组小管形成情况并拍照，100倍下每组随机选取5个视野，计数形成小管的分支点数，取平均值进行统计分析。

1.6.2 Real time-PCR检测HTR-8/SVneo细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的表达 按“1.5”项下进行细胞分组与干预。细胞培养48 h后，采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA并测定其浓度，按照试剂盒说明书合成cDNA，进行Real time PCR，应用2－ΔΔCt对基因进行相对定量计算。反应条件：95℃1 min预变性；95℃5 s变性，58℃15 s退火，72℃30 s延伸，共40个循环。

1.6.3 Western Blotting检 测HTR-8/SVneo细 胞HIF-1α、VEGFA蛋白的表达 按“1.5”项下进行细胞分组与干预。细胞培养48 h后分别加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，离心提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组等量上样，10%SDSPAGE电泳，350 mA转膜60 min，5%的BSA室温封闭1 h，孵育HIF-1α、VEGFA（稀释倍数1∶200）和GAPDH（稀释倍数1∶400）一抗工作液4℃过夜，TBST洗膜8 min×5次，室温摇动孵育二抗工作液1 h，TBST洗膜8 min×5次，ECL发光显影，用Image J分析软件对条带进行定位和分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞血管形成能力比较 与空白组比较，低氧模型组、补肾活血方冻干粉各剂量组小管形成能力明显升高（P＜0.05）；与低氧模型组比较，补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组小管形成能力升高（P＜0.05）；补肾活血方冻干粉高剂量组小管形成能力高于补肾活血方冻干粉中、低剂量组（P＜0.05），补肾活血方冻干粉低剂量组小管形成能力与补肾活血方冻干粉中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图1、表2）

图1 各组细胞小管形成能力

表2 各组细胞小管形成能力比较（±s）

表2 各组细胞小管形成能力比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与低氧模型组比较，bP＜0.05；与补肾活血方冻干粉低剂量组比较，cP＜0.05；与补肾活血方冻干粉中剂量组比较，dP＜0.05

组别 n 给药剂量(mg/L)小管分支点数空白组 3 - 12.35±1.25低氧模型组 3 - 27.76±1.79a补肾活血方冻干粉低剂量组 3 5 31.61±0.82a b补肾活血方冻干粉中剂量组 3 10 33.24±1.22a b补肾活血方冻干粉高剂量组 3 25 38.84±1.68a b c d

2.2 各组细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表达情况 与空白组比较，补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA的相对表达量升高（P＜0.05），低氧模型组和补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组VEGFA mRNA的相对表达量升高（P＜0.05）；与低氧模型组比较，补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA的相对表达量升高（P＜0.05），补肾活血方冻干粉中、高剂量组VEGFA mRNA的相对表达量升高（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05）。与补肾活血方冻干粉低剂量组比较，补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的相对表达量升高（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表达比较（±s）

表3 各组细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与低氧模型组比较，bP＜0.05；与补肾活血方冻干粉低剂量组比较，cP＜0.05

组别 n给药剂量（mg/L）HIF-1αmRNA VEGFA mRNA空白组 3 - 1.01±0.18 1.03±0.28低氧模型组 3 - 1.11±0.12 1.93±0.13a补肾活血方冻干粉低剂量组3 5 1.20±0.14 2.43±0.24a补肾活血方冻干粉中剂量组3 10 1.22±0.10 2.79±0.29ab补肾活血方冻干粉高剂量组3 25 1.50±0.15abc 3.01±0.47abc

2.3 各组细胞HIF-1α、VEGFA蛋白表达情况 与空白组比较，低氧模型组及补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组HIF-1α、VEGFA蛋白的相对表达量均升高（P<0.05）；与低氧模型组比较，补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组HIF-1α、VEGFA蛋白的相对表达量均升高（P<0.05）。与补肾活血方冻干粉低剂量组比较，补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1α、VEGFA蛋白的相对表达量升高（P<0.05）；与补肾活血方冻干粉中剂量组比较，补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1α蛋白的相对表达量升高（P<0.05），而VEGFA蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。（见图2、表4）

图2 各组细胞HIF-1α、VEGFA蛋白表达情况

表4 各组细胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相对表达量比较（±s）

表4 各组细胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与低氧模型组比较，bP<0.05；与补肾活血方冻干粉低剂量组，cP<0.05；与补肾活血方冻干粉中剂量组比较，dP<0.05

组别 n给药剂量（mg/L）VEGFA HIF-1α空白组 3 - 0.25±0.05 0.03±0.01低氧模型组 3 - 0.51±0.01a 0.20±0.07a补肾活血方冻干粉低剂量组3 5 0.70±0.11ab 0.43±0.08ab补肾活血方冻干粉中剂量组3 10 0.81±0.09ab 0.40±0.09ab补肾活血方冻干粉高剂量组3 25 0.84±0.12abc 0.66±0.07abcd

3 讨 论

复发性流产的不良生育现状是育龄期及高龄产妇所面临的严峻问题，由于其难治性，给患者及家庭造成极大的身体和精神痛苦。中医学对RSA的诊治有着丰富的理论及实践经验。隋代巢元方在《诸病源候论·妇人妊娠病诸候上》中首先提出了：“妊娠数堕胎候”[7]。古代多数医家将数堕胎、滑胎的病因归结为肾虚、气血虚弱及血瘀。《素问·奇病论篇》中提到包络系于肾，认为胚胎发育与肾脏关系密切。肾为先天之本，主藏精、主生殖，胞胎所养，胚胎的着床发育均依靠先天肾精的滋养和肾气的固护[8]。清代张锡纯《医学衷中参西录》创制的寿胎丸防治滑胎流传至今[9]。王清任在《医林改错》中提出滑胎与血瘀相关的观点：“不知子宫内，先有瘀血占其地，胎至三月再长，其内无容身之地，胎病靠挤血不能入胎胞，从傍流而下，故先见血。血既不入胎胞，胎无血养，故小产。”其创立的“少腹逐瘀汤”成为治疗血瘀型滑胎的代表方剂[10]。活血类药物虽属妊娠禁忌药，但是遵循《素问·六元正纪大论篇》“有故无殒，亦无陨，衰其大半而止”的治疗原则，医者不拘于成见，可取得良好疗效[11]。根据复发性流产“肾虚血瘀”的病机特点，李佶提出的补肾活血方具有补肾活血安胎之效，在治疗复发性流产的12周妊娠通过率及妊娠结局疗效满意[3]，但现代药理机制尚不明确。

胚胎生长发育的细胞生物学过程极其精细而复杂。在妊娠早期，胚胎和胎盘发育都在特定的氧浓度下进行，氧被认为是滋养细胞增殖和分化的主要调节因素，胎盘发育是在相对缺氧的环境中发生。1996年GENBACEV O等[12]首先提出低浓度氧可提升人早孕期滋养细胞的增殖，而大气中氧浓度（21% O2，海平面水平）则刺激分化。妊娠10周前，EVT在螺旋动脉内形成“滋养细胞栓”，成功地防止母体血液进入绒毛间隙，从而创建了早期妊娠生理性低氧环境（2%~3% O2）[13]。早孕期，滋养细胞在低氧条件下增殖，孕12周以后，胎盘绒毛经历着缺血再灌注，随之滋养细胞周围氧浓度逐渐增加（8% O2），在高氧条件下分化成具有侵袭表型的滋养细胞，逐步浸润到子宫膜、子宫肌层的浅1/3及相关的螺旋小动脉，确保广泛的螺旋动脉重铸[14]。

机体通过调节一系列基因表达的变化来适应慢性低氧环境，其中缺氧诱导因子1（HIF-1）受缺氧的诱导，在低氧状态的调控中发挥转录调控作用。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β构成的2个亚基的异源二聚体，其中HIF-1α亚基表达受低氧诱导，HIF-1β亚基属构建型表达，不受低氧的调节和影响。人类胎盘在氧合方面提供了一个独特的环境，经历了一个从缺氧环境到更高氧合环境的过渡，这种氧张力和动态HIF-α信号的生理开关是胎盘发育所必需的[15]。在缺氧情况下，HIF-1α的泛素-蛋白酶体降解途径被阻断导致其在细胞内蓄积，从而启动下游因子的转录与翻译。HIF-1α在妊娠早期调节滋养细胞对缺氧条件的适应，稳定的HIF-1α转运到细胞核，与血管生成调节的靶基因缺氧反应元件结合，诱导胚胎新生血管生成，增加血管通透性，减轻组织缺氧情况[16]。血管表皮生长因子（VEGF）属于一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，是受HIF-1α调控的下游因子之一，HIF-1α与VEGF的缺氧反应元件结合后启动其转录与翻译，使其相关产物表达增加，VEGF在低氧条件下表达也被上调[17]。VEGFA是VEGF生长因子家族的重要成员之一，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移及血管形成等作用。研究证实VEGF的表达减弱与早孕丢失有关[18]。ZHU L J等[19]通过对稽留流产患者及健康早孕女性孕7~10周的绒毛组织进行比较，显示稽留流产患者绒毛组织中活性氧簇（ROS）水平明显增高，而HIF-1α浓度明显降低。这提示高氧状态可引起HIF-1α低表达，滋养细胞增殖力下降，血管生成障碍导致SPA重铸不足。NÜSKEN E等[20]报道了缺氧条件下（0.1%、1%、3% O2）培养正常足月胎盘原代滋养层细胞中HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表达的增加。WANG K等[21]在低氧处理的人滋养层细胞系HTR-8/SVneo中也取得了同样的结果。研究显示活血化瘀中药可以增加血管内皮细胞对VEGF的敏感性，进而促进血管出芽、生长，形成新的血管新枝，促进血管的生成与重建[22]。郝乐乐等[23]研究证实补肾安胎冲剂能改善复发性流产小鼠母胎界面血管生成，提高血清和蜕膜组织中HIF-1α蛋白水平和HIF-1αmRNA表达水平，因此，HIF-1α适度表达与维持正常妊娠的表达相关。

CoCl2是比较常用的低氧模型诱导剂，本实验通过模拟低氧环境发现了HIF-1α/VEGFA信号通路在胚胎发育过程中的调节作用。研究结果显示低氧环境可以促进绒毛血管生成，在补肾活血方冻干粉的作用下可以使体外培养的HTR-8/SVneo滋养细胞小管形成进一步增加，同时提高滋养细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA和蛋白的表达。妊娠早期HIF-1αmRNA活性的上调提高了组织细胞在缺血缺氧情况下的存活能力，增加组织在缺氧环境中的血管生成；但组织若长期处于缺氧环境下HIF-1α的表达可能降低。此外，随着妊娠进程胚胎发育氧含量向正常转变，为了防止胚胎受到再灌注过程中氧自由基的损害，HIF-1α可以改善胚胎组织细胞低氧环境下的能量代谢[24]。因此，补肾活血方对RSA作用机理还有待进行更加深入的探讨。综上所述，本研究探讨了绒毛血管生成与HIF-1α/VEGFA信号通路之间的关系及补肾活血方的调控作用，为临床应用补肾活血方治疗RSA提供了一定的理论依据。