益心泰颗粒对慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水停证大鼠心肌AMPK蛋白表达的影响*

唐 云，雷 洋

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中医药研究院文献信息研究所，湖南 长沙 410006）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）患病率高，病死率高，我国2003年的数据显示患病率约为0.9%，死亡率约6.2%[1]。随着对心力衰竭的重视，全国各地心力衰竭中心的成立，药物规范化方案的不断改进，以及诺欣妥等新药的出现，使CHF的再住院率和死亡率有所下降[2]。但随着年龄的增大，其患病率升高，我国已逐步向老年化时代迈进，且随着冠心病、高血压等其基础疾病的患病率逐年升高，故CHF患病率仍居高不下，死亡率亦未得到显著控制。心室重构与代谢障碍是CHF的两大重点特点，且二者具有双向调控[3]。单磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMPK）是心脏的能量感受器，参与AMPK/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1（PGC-1）α、AMPK/过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α等多条能量代谢信号通路，不仅可以调节心肌能量代谢，还与心肌肥大密切相关[4]。前期研究显示益心泰颗粒可以改善CHF心室重构[5]。本课题选择AMPK等指标，从能量角度探讨益心泰颗粒改善CHF的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄健康SPF级雄性BN（Brown Nonway）大鼠87只，体质量180~220 g，均由湖南斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证编码：SCXK(湘)2019-009，该实验通过伦理审核（批号：LL201801010801）。

1.2 药物与试剂 益心泰颗粒(由黄芪、丹参、泽泻等组成，每克颗粒含生药3.1 g，湖南中医药大学第一附属医院)；注射用盐酸多柔比星（ADR）（深圳万乐药业有限公司，规格：10mg/瓶，批号：H44024361）；盐酸曲美他嗪片（施维雅天津制药有限公司，规格：20 mg/片，批号：H20055465）；丙硫养嘧啶片（PTU）（上海复星朝辉药业有限公司，规格：50mg/片，批号：H31021082）。血清氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、游离脂肪酸（FFA）Elisa试剂盒（美国RD公司）；超微量Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶测试盒（南京建成生物功能研究所）；AMPK抗体（美国abcam公司）。

1.3 主要仪器 多普勒超声诊断仪（荷兰Philips公司）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；伯乐半干转膜（北京优尼康生物科技有限公司）；酶标仪（芬兰雷勃）；全自动生化分析仪（日本日立高新技术公司）。

1.4 造模 采用PTU灌胃及ADR腹腔注射造模，具体方法、造模评判标准参考文献[6]。随机选取75只大鼠造模，予以PTU灌胃，灌胃量为大鼠每日进食量的0.2%，1次/d；同时以3.5 mg/kg的ADR腹腔注射，1次/周。CHF模型成功标准：LVEF≤50%；心气虚兼血瘀水停证模型成功评判标准：心悸（心率加快），神疲乏力（力竭性游泳时间减少），胸部满闷（全心质量指数升高），胁下痞块（肝重指数升高），浮肿尿少（尿量减少）；同时符合2者，提示造模成功，造模共6周。

1.5 分组与给药 将造模成功的70只大鼠按心功能分层后再随机分为模型组、益心泰高剂量组（10.4 g/kg）、益心泰中剂量组（5.2 g/kg）、益心泰低剂量组（2.6 g/kg）及曲美他嗪组（10 mg/kg），每组14只；另设正常对照组12只，各药物组予相应药物灌胃，模型组及正常对照组予以等体积的蒸馏水灌胃，1次/d，灌胃体积为10 mL/kg，灌胃4周。剂量换算方法为按人大鼠体表面积换算。

1.6 观察指标

1.6.1 血清NT-proBNP、FFA水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，离心，取上层血清，其中血FFA采用全自动生化分析仪检测，血清NT-proBNP采用酶联免疫法检测，具体方法按说明书执行。

1.6.2 心肌Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性 麻醉后，空气栓塞法处死，取出左心室心肌组织，检测方法按说明书执行。

1.6.3 心肌AMPK蛋白表达检测 采用Western blotting法检测。匀浆组织，使充分裂解，将裂解液样品离心，取上清，酶标板计算样品蛋白质浓度，上样及电泳，采用半干式转膜，检测膜上蛋白，封闭及孵育抗体，显色及图像分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS20统计软件处理，计量资料以（±s）表示。多组之间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 药物治疗期间，除正常对照组和曲美他嗪组外，其他各组均有死亡，死亡大鼠尸体解剖后，发现死亡原因均为心力衰竭，实验结束时，正常对照组、模型组、益心泰低剂量组、益心泰中剂量组、益心泰高剂量组、曲美他嗪组存活数分别为12只、11只、12只、13只、12只、14只。

2.2 各组大鼠血清NT-proBNP、FFA比较 模型组血清NTproBNP、FFA均显著高于正常对照组（P＜0.01）。各给药组血清NT-proBNP、FFA均明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰低剂量组血清NT-proBNP、FFA均明显高于益心泰中剂量组、益心泰高剂量组与曲美他嗪组（P＜0.05）；而益心泰中、高剂量组血清NT-proBNP、FFA比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清NT-proBNP、FFA比较（±s）

表1 各组大鼠血清NT-proBNP、FFA比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与曲美他嗪组比较，dP＜0.05；与益心泰低剂量组比较，eP＜0.01

组别 动物数（只）NT-proBNP（pg/mL）FFA（mmol/L）正常对照组 12 108.39±20.46 0.36±0.12模型组 11 387.02±31.97a 1.52±0.41a益心泰低剂量组 12 311.54±27.45b d 1.17±0.38b d益心泰中剂量组 13 218.30±19.28c e 0.72±0.30c e益心泰高剂量组 12 190.27±24.32c e 0.68±0.24c e曲美他嗪组 14 183.83±21.78c e 0.75±0.31c e

2.3各组大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值比较 模型组心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均显著低于正常对照组（P＜0.01）。各给药组心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。益心泰低剂量组心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均低于益心泰中剂量组、益心泰高剂量组与曲美他嗪组（P＜0.05）；益心泰中、高剂量组心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度差异值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值比较（±s）

表2 各组大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与曲美他嗪组比较，dP＜0.05；与益心泰低剂量组比较，eP＜0.01

Na+，K+-ATP酶 Ca2+，Mg2+ATP酶(μmolPi/mg(prot)/h)(μmolPi/mg(prot)/h)正常对照组 12 3.95±0.90 1.84±0.36 0.85±0.19模型组 11 2.47±0.63a 0.58±0.22a 0.21±0.08a益心泰低剂量组12 2.84±0.35bd 0.92±0.43bd 0.35±0.10bd益心泰中剂量组13 2.96±0.52b 1.29±0.51b 0.49±0.13c益心泰高剂量组12 3.28±0.46ce 1.37±0.53ce 0.56±0.27ce曲美他嗪组 14 3.16±0.71ce 1.46±0.58ce 0.54±0.15c组别 动物数（只）AMPK/β-actin

图1 各组大鼠心肌AMPK蛋白表达

3 讨 论

中医古籍无CHF病名，直至1997年国家才明确心力衰竭病名，但中医古籍有“心衰”病名的相关记载，且描述心衰相关症状的篇幅很多，可见中医对心衰的认识较为深刻。《素问·逆调论篇》云：“若心气虚衰，可见喘息持续不已”，而喘息是心衰的重要临床症状之一，故这里描述的就是心衰，并指出心气虚衰是其发病的病机。《读医随笔·承制生化论》云：“气虚不足以推血，则血必有瘀”，指出气虚无力推动血液，可以导致血液瘀滞。《素问·调经论篇》记载“瘀血不去，其水乃成冶”，瘀血长时间无法得到有效治疗，易导致水液代谢失常，最终可以出现水饮内停。且气虚运化水湿不利亦导致水停，而水饮内停又出现水饮凌心影响心气的运行，加重血瘀，心气虚、血瘀、水停三者形成恶性循环，故CHF病机可用“虚”“瘀”“水”概括[7]。益心泰颗粒中黄芪善于补气，且能利尿，可以改善心肌能量代谢，抑制心肌纤维化，改善心功能[8]。丹参、红花活血化瘀，均可抑制肾素-血管紧张素系统，改善心室重构[9-10]。泽泻、猪苓利尿，现代药理研究表明泽泻、猪苓均可利尿、抗炎、抗氧化、调节免疫[11-12]。BNP、NT-proBNP与CHF关系密切，是诊断CHF的重要生化指标，且可以作为CHF疗效的评判标准，还可作为CHF预后的指标。但NT-proBNP生物稳定性好，且在血液中浓度高，故临床上常用其来评判CHF[13]。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组NT-proBNP明显升高（P＜0.01），故其也可作为诊断CHF的重要指标。治疗后，与模型组比较，益心泰颗粒低、中、高剂量组NT-proBNP均明显下降，提示益心泰颗粒可以有效治疗CHF。

AMPK是细胞能量的关键调节因子，当机体处于代谢应激状态时，可减少ATP分解代谢，促进ATP合成代谢[14]。CHF时，心肌细胞处于缺血缺氧状态，AMPK被快速激活，使FFA氧化增加，增加相同氧量情况下ATP的生成，优化了心肌的能量代谢[15]。ATP是心肌直接利用的能量物质，主要包括Na+，K+-ATP、Ca2+，Mg2+-ATP，其广泛存在于心肌组织，与心肌收缩、舒张功能密切相关，是反映心肌能量代谢的重要指标[16]。ATP释放能量，需要相应酶的参与，ATP酶活性降低导致衰竭的心肌细胞出现ATP利用障碍[17-18]。故检测Na+，K+-ATP酶与Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性，就可反映ATP的情况。FFA是心肌处于缺血缺氧状态下，能量的重要来源，当CHF时，其水平明显升高，与NT-proBNP呈正相关，且可反映CHF的严重程度[19]。曲美他嗪可提高线粒体活性，释放更多ATP，改善心肌能量代谢[20]。本实验结果显示，曲美他嗪组血清NT-proBNP、FFA显著低于模型组（P＜0.01），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均显著高于模型组（P＜0.01），提示曲美他嗪可以促使AMPK蛋白表达增加，增加ATP酶活性，抑制脂肪酸氧化，降低血清NT-proBNP水平，改善心衰。益心泰低、中、高剂量组血清NT-proBNP、FFA均明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），这与曲美他嗪在治疗CHF心肌能量代谢方面作用相同。剂量间比较显示，与益心泰低剂量组比较，益心泰中、高剂量组血清NT-proBNP、FFA均明显降低（P＜0.05），而心肌Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性、AMPK蛋白相对灰度值均明显升高（P＜0.05），且益心泰中、高剂量组以上指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示益心泰颗粒高、中剂量疗效优于低剂量，且中剂量后，药效已达最大疗效。

综上所述，益心泰颗粒可促使AMPK蛋白表达增加，增加ATP酶活性，抑制脂肪酸氧化，降低血清NT-proBNP水平，改善心衰。