Box-Behnken设计-效应面法优化延胡索乙素聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒处方和体外释药行为研究

尹元元，耿燕娜，范明松

·药剂与工艺·

Box-Behnken设计-效应面法优化延胡索乙素聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒处方和体外释药行为研究

尹元元1，耿燕娜1，范明松2*

1.河南大学淮河医院，河南 开封 475000 2.上海雷允上药业有限公司技术中心，上海 201401

Box-Behnken设计-效应面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）优化延胡索乙素（THP）聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］纳米粒（THP-PLGA-NPs）处方，并进行体外评价。纳米沉淀法制备THP-PLGA-NPs，以包封率、载药量、多分散系数（polydispersity index，PDI）和粒径大小为评价指标，单因素结合BBD-RSM筛选最优处方，采用甘露醇作为冻干保护剂制备成冻干粉，将最优处方进行表征及体外释放实验。最佳处方为PLGA用量为491.8 mg、油水体积比1∶5.2、乳化剂质量分数为1.12%。THP-PLGA-NPS包封率为（185.07±1.06）%，载药量为（4.73±0.21）%，粒径为（181.32±7.14）nm，分别与模型预测值接近。体外释药具有明显的缓释特征，释药过程符合Higuchi模型：M/M＝0.112 41/2＋0.078 0，＝0.987 9。Box-Behnken实验设计可用于THP-PLGA-NPS处方的筛选，且优化后的纳米粒具有缓释作用。

延胡索乙素；PLGA纳米粒；纳米沉淀法；处方优化；Box-Behnken设计-效应面法；缓释特征；体外释放

延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是一种异喹啉类生物碱，主要从罂粟科紫堇属植物延胡索W.T.Wang提取得到[1]。研究发现，THP具有抗肿瘤、降血压、抗心律失常、镇痛、神经保护、抗焦虑等多种药理活性[2-4]。但THP体内稳定差[5]，不易溶于水[6]，体外溶出受限，生物利用度低[5]。而且THP具有一定的急性毒性[7]，安全性存在一定隐患，故传统制剂不利于THP发挥药效，在临床上的应用受到较大限制。

纳米给药系统可改善难溶性药物的溶解度和溶出度，提高药物的生物利用度，提高靶向性及药效，降低毒副作用等，因而在医药研发领域颇受专家学者关注[8]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co- glycolic acid)，PLGA］是一种安全、无毒且可生物降解的纳米载体，最终产物是二氧化碳和水[9-10]，已被美国FDA批准用于临床研究，国内外研究者采用PLGA制备纳米粒的研究越来越多[11-14]，有效提高了生物利用度及药效。Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）是常用的处方优化方法，具有精确度高、预测性强等特点[15-16]。

因此，本研究采用BBD-RSM对THP-PLGA纳米粒（THP-PLGA-NPs）处方进行研究，在单因素考察的基础上，选择PLGA用量、油水体积比和乳化剂质量分数分别作为自变量，选择包封率、载药量和粒径大小分别作为因变量，期望得到具有理想包封率、载药量和粒径的THP-PLGA-NPs处方。进一步制备成冻干粉，考察稳定性及体外释药情况，期望通过本研究为THP纳米制剂研发提供参考，也为后续体内药动学、药效学等评价奠定基础。

1 仪器与材料

1260型高效液相色谱仪（HPLC），配置DAD检测器，Agilent公司；QUINTIX125D-1CN型电子天平，赛多利斯仪器公司；ZNCL-S-5D型多点数显磁力搅拌器，上海越众仪器设备有限公司；RC-6D型溶出仪，天津创兴电子设备制造股份有限公司；DW-86L388J型超低温冰箱，深圳市科力易翔仪器设备有限公司；12V20AH型超声仪，苏州东风亚森新能源科技有限公司；Master-sizer型粒度分析仪，马尔文仪器公司；JSM-IT500型扫描电子显微镜（SEM），日本电子株式会社；CTFD-12P型真空冻干机，深圳市科力易翔仪器设备有限公司；GXF-03A型气动安瓿轧盖机，广州冠鑫轻工机械制造有限公司。

THP对照品，批号110726-202020，质量分数99.3%，中国食品药品检定研究院；THP原料药，批号200216，质量分数98%，成都嘉叶生物科技有限公司；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），75∶25，相对分子质量为15 000～20 000，德国Evonik Industries公司；甘露醇（批号20191105）、蔗糖（批号20200302）、乳糖（批号20190915），上海康朗生物科技有限公司；泊洛沙姆188，批号WPEE587E，德国巴斯夫有限公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）柱；流动相为甲醇-0.1%乙酸水溶液（稀三乙胺调pH值至5.8左右）（60∶40）；体积流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为281 nm；进样体积为10 µL。THP在8.2 min左右出峰，理论塔板数以THP计不低于8500，色谱图见图1。

图1 THP对照品(A) 和THP-PLGA-NPs样品(B)、空白(C) 的HPLC图

2.1.2 供试品溶液的配制 精密量取1 mL的THP- PLGA-NPs混悬液至50 mL量瓶中，加入10 mL丙酮，超声5 min以破坏THP-PLGA-NPs，放置至室温，甲醇定容至刻度线，即得THP-PLGA-NPs供试品溶液。空白PLGA纳米粒供试品溶液同法制备。

2.1.3 对照品储备液的配制及线性关系考察 精密称取THP对照品10 mg溶于100 mL甲醇，得质量浓度为100 μg/mL的THP对照品储备液。流动相作为稀释液，分别配制质量浓度为20.00、10.00、5.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL的THP对照品溶液，分别进样，测定各个质量浓度的峰面积。以THP质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），得线性回归方程＝18.157 4－0.523 8，＝0.999 9，因此THP在0.05～20.00 μg/mL线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 取质量浓度为0.05、5.00、20.00 μg/mL的THP对照品溶液，分别进HPLC测定6次，计算得THP峰面积的RSD值分别为0.56%、0.34%、0.32%，可见仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取THP-PLGA-NPs供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h进样测定THP，计算得THP峰面积的RSD值为0.73%，所以供试品溶液在24 h稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取THP-PLGA-NPs混悬液，按照“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定THP，计算得THP质量浓度的RSD值为1.63%，所以重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取9份0.5 mL的THP- PLGA-NPs混悬液，分为3组，每组各3份，分别加入100 μg/mL THP对照品贮备液1.5、3.0、4.5 mL。按照“2.1.2”项下方法操作，分别制备THP-PLGA- NPs供试品溶液，进样测定，计算THP含量及回收率。结果显示，THP的平均加样回收率为100.26%，RSD为1.84%，可见回收率较高。

2.2 THP-PLGA-NPs的制备[11]

沉淀法制备THP-PLGA-NPs。取30 mg的THP和适量的PLGA溶于20 mL有机溶剂中，超声溶解得有机相。配制一定体积、一定浓度的稳定剂水溶液作为水相。将有机相用注射器逐滴滴加至水相中，滴毕后于一定功率下超声（工作2 s，间隔1 s）。减压旋蒸除尽有机溶剂，过0.45 μm微孔滤膜，即得THP-PLGA-NPs混悬液。

空白PLGA-NPs除不加THP外同法制备。

2.3 包封率、载药量、粒径及Zeta电位的测定

取1 mL的THP-PLGA-NPs混悬液至离心管中，于温度为4 ℃的条件下12 000 r/min高速离心30 min，取续滤液测定游离THP质量浓度，计算含量（游离）。精密量1 mL THP-PLGA-NPs至50 mL量瓶，加入10 mL丙酮，超声5 min破坏THP-PLGA- NPs，放置至室温，甲醇定容至刻度线，进样测定THP质量浓度，计算THP总含量（总）。取1 mL的THP-PLGA-NPs混悬液于−60 ℃预冻2 d后低温冻干，称质量（0）。按下式计算THP-PLGA-NPs的包封率和载药量。

包封率＝(总－游离)/总

载药量＝(总－游离)/0

取THP-PLGA-NPs混悬液0.1 mL，加入蒸馏水4 mL混匀，取适量置于比色皿中，于粒度分析仪上测定THP-PLGA-NPs的粒径、PDI和Zeta电位。

2.4 THP-PLGA-NPs单因素考察

2.4.1 有机溶剂种类的考察 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg，泊洛沙姆188质量分数为0.8%，油水体积比为1∶5，超声功率为250 W，超声时间为10 min，减压旋蒸为3 h的条件下，分别考察丙酮、二氯甲烷和两者等量混合溶剂作为有机溶剂时对THP-PLGA-NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表1。不同溶剂对THP-PLGA-NPs包封率、载药量和粒径等有较大的影响，二氯甲烷的包封率和载药量高于丙酮，可能是由于二氯甲烷脱除速率较快，降低了药物进入水相几率，有利于PLGA材料包裹药物。而采用丙酮和二氯甲烷混合溶剂制备的THP-PLGA-NPs包封率和载药量相对更高，且粒径、PDI相对较小，Zeta电位绝对值相对较大，故选择丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂来制备THP-PLGA-NPs。

2.4.2 PLGA用量的考察 固定THP用量为30 mg，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，泊洛沙姆188质量分数为0.8%，油水体积比为1∶5，超声功率为250 W，超声时间为10 min，减压旋蒸为3 h的条件下，考察PLGA用量为400、450、500、550 mg时对THP-PLGA-NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表2。随着PLGA用量的增加THP-PLGA-NPs粒径呈增大趋势，可能是由于PLGA用量的增加提高了体系的黏度所致。随着PLGA用量的增加，包封率总体呈增加趋势，但增加到一定程度后载药量下降明显。当PLGA用量为500 mg左右时THP-PLGA-NPs的各个指标均较好，但需要进行进一步优化。

表1 有机溶剂种类的考察(, n = 3)

2.4.3 油水体积比的考察 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，泊洛沙姆188质量分数为0.8%，超声功率为250 W，超声时间为10 min，减压旋蒸为3 h的条件下，分别考察油水体积比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6时对THP-PLGA-NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表3。随着水相体积的增加，HP-PLGA纳米粒的粒径和PDI值呈减小趋势。包封率和载药量先增大后减小，可能是随着水相体积的增大，在乳化剂增溶作用下使药物进入水相，影响了PLGA材料对药物的包裹。综合考虑，选择油水体积比为1∶5左右继续进行后续优化。

表2 PLGA用量的考察(, n = 3)

2.4.4 乳化剂质量分数的考察 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，油水体积比为1∶5，超声功率为250 W，超声时间为10 min，减压旋蒸为3 h的条件下，分别考察乳化剂质量分数对THP-PLGA-NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表4。随着乳化剂质量分数的增加，包封率和载药量均呈先增加后减少趋势，而粒径呈现变小后增大。这可能是当乳化剂质量分数不足时影响乳化效果，导致PDI值较高，且Zeta电位绝对值也较低，但质量分数过高时则使药物进入水相，影响PLGA材料的包裹。随着乳化剂质量分数的增加，油水界面张力下降，故形成纳米粒粒径较小，当进一步增加乳化剂质量分数时体系的黏度也随之上升，使形成纳米粒的粒径反而变大，PDI值也有变大趋势。综合考虑，需选择乳化剂质量分数为1.0%左右继续进行处方优化。

2.4.5 超声时间的影响 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，油水体积比为1∶5，乳化剂质量分数为1.0%，超声功率为250 W，减压旋蒸为3 h条件下，分别考察超声时间对THP-PLGA-NPs的影响，结果见表5。随着超声时间的增加，包封率、载药量和Zeta电位绝对值均先增加后减小，可能是超声时间过长时对PLGA纳米粒有一定的破坏作用所致。粒径和PDI值先变小后变大，可能是过长的超声时间使纳米粒重新聚集，导致平均粒径变大，同时PDI值也上升。虽然超声12 min具有较小的粒径，但包封率和载药量明显低于超声10 min时的包封率和载药量，且超声12 min时的PDI值也相对高。综合考虑，故选择超声时间为10 min。

表3 油水体积比的考察(, n = 3)

表4 乳化剂质量分数的考察(, n = 3)

2.4.6 超声功率的影响 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，油水体积比为1∶5，乳化剂质量分数为1.0%，超声时间为10 min，减压旋蒸为3 h条件下，考察超声功率对THP-PLGA-NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表6。超声功率达到300 W时，THP-PLGA-NPs的封率和载药量下降明显，粒径和PDI值变大趋势明显。功率为200 W时THP-PLGA-NPs包封率、载药量相对最高，且粒径和PDI值相对最小，故选择超声功率为200 W。

表5 超声时间的考察(, n = 3)

2.4.7 减压旋蒸时间的影响 固定THP用量为30 mg，PLGA用量为500 mg，有机溶剂为丙酮和二氯甲烷等量混合溶剂，油水体积比为1∶5，乳化剂质量分数为1.0%，超声时间为10 min，超声功率为200 W的条件下，考察减压旋蒸时间对THP-PLGA- NPs包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的影响，结果见表7。减压旋蒸时间过短时，可能是由于残留的有机溶剂会破坏THP-PLGA-NPs，导致包封率、载药量较低，但旋蒸时间过长时THP-PLGA-NPs可能会发生聚集，导致粒径和PDI值变大。经测定，旋蒸时间为3.5 h时有机溶剂基本被旋蒸除去，故选择旋蒸时间为3.5 h。

表6 超声功率的考察(, n = 3)

表7 减压旋蒸时间的考察(, n = 3)

2.5 BBD-RSM优化处方

2.5.1 试验设计 单因素实验结果显示，PLGA材料的用量、油水体积比和乳化剂质量分数（分别作为自变量1、2、3）对纳米制剂的包封率、载药量和粒径大小（分别作为响应值1、2、3）影响较大，因此采用BBD-RSM对THP-PLGA-NPs处方进行进一步优化，因素及水平试验设计见表8。

将包封率、载药量和粒径归一化处理得出总评归一值（OD），并以OD值为BBD-RSM的响应指标。计算过程为①包封率（1）和载药量（2）越大越好，max＝(M－min)/(max－min)；而粒径（3）越小越好，min＝(max－M)/(max－min)，max和min分别为试验中最大值和最小值，M为试验中的测量值。②各指标归一值求算几何平均数，得总评归一值OD＝(12…d)1/k，为指标数，结果见表8。

2.5.2 模型的拟合、效应面优化与预测 采用Design Expert V8.0.6软件进行拟合，总评分OD值二次多元回归方程为OD＝0.96－0.0201＋0.0172＋0.0673－0.02412＋0.3.16×10−313＋0.04023－0.27012－0.06122－0.61032。模型的值＜0.01，说明模型具有极显著性意义，失拟项＝0.149 9＞0.05，说明未知因素对模型干扰很小。另外模型的2＝0.995 8，adj2＝0.990 4，说明模型与实际吻合度良好，因此可以采用此模型对THP-PLGA-NPs处方进行研究，可信度较高。方差分析结果见表9，模型中3、23、12、22和32均显著或极显著（＜0.05、0.01）。

表8 BBD-RSM试验设计的因素水平及结果

固定PLGA材料的用量（1）、油水体积比（2）和乳化剂质量分数（3）因素中之一，得到另外2因素对OD值的三维曲面图，结果见图2。得到THP- PLGA-NPs最佳处方为PLGA用量为491.8 mg、油水体积比1∶5.2、乳化剂质量分数为1.12%。在此条件下THP-PLGA-NPs包封率、载药量和粒径大小的预测值分别为85.95%、4.85%和176.46 nm。

2.6 工艺验证

分别测定3批THP-PLGA-NPs最佳处方的包封率、载药量和粒径，并与预测值相比较，计算实际值与预测值的偏差［偏差＝(预测值－实际值)/预测值］。结果见表10，实际值与预测值相对偏差均较小，均小于±5%，说明THP-PLGA-NPs实际测得的包封率、载药量和粒径大小与预测值较为接近，证明了采用Box-Behnken响应面法优化THP-PLGA- NPs处方具有良好的预测性，可靠性较高。THP- PLGA-NPs粒径分布图和Zeta电位图分别见图3和图4。

2.7 THP-PLGA-NPs外观及SEM观察

THP-PLGA-NPs，外观见图5-A，略带浅蓝色乳光。取THP-PLGA-NPs混悬液0.1 mL，加入10 mL蒸馏水，混匀滴于铜柱，并常温下自然挥干，于真空条件下喷金后置于SEM下观察THP-PLGA-NPs外貌形态，结果见图5-B。THP-PLGA-NPs外貌形态为椭圆形或球形粒子，各个粒子之间无粘连。

表9 方差分析

图2 各因素与响应值的三维图

表10 预测值和实际值的比较(, n = 3)

图3 THP-PLGA-NPs的粒径分布

图4 THP-PLGA-NPs的Zeta电位

图5 THP-PLGA-NPs的外观 (A) 及SEM图(B)

2.8 THP-PLGA-NPs冻干粉的制备

2.8.1 冻干工艺及结果 取THP-PLGA-NPs混悬液加入一定量的冻干保护剂，混匀，于−60 ℃超低温冰箱预冻1 d。置于−35 ℃冷冻干燥机中按照表11冻干程序进行冻干，即得不同质量分数、不同种类冻干保护剂的THP-PLGA-NPs的冻干粉末，分别评价冻干粉的外观、色泽和分散时间，结果见表12。

蔗糖作为冻干保护剂时外观、色泽和分散时间均不理想，当乳糖质量分数大于6%时虽外观和色泽较为理想，但分散时间稍长，故最终选择6%的甘露醇作为THP-PLGA-NPs的冻干保护剂，外观饱满，色泽均一，分散时间小于10 s。冻干粉外观见图6。

表11 冻干程序

表12 考察结果(n = 3)

2.8.2 THP-PLGA-NPs冻干粉稳定性考察 取THP- PLGA-NPs混悬液置于干燥器中，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d取0.1 mL，加入蒸馏水4 mL稀释混匀，记录粒径和Zeta电位。取THP-PLGA-NPs冻干粉适量，0.1 mL蒸馏水复溶后同法操作，结果见表13。未冻干时，THP-PLGA- NPs 30 d后包封率下降超过20%，而冻干后包封率下降3%左右。未冻干时，30 d后粒径增长至（343.94±36.48）nm，而冻干后粒径增长幅度明显较小。THP-PLGA-NPs冻干后PDI虽有变大趋势，但30 d后仍小于0.3。因此，将THP-PLGA-NPs混悬液制备成冻干粉后有助于增加其稳定性。

图6 冻干粉外观

2.9 体外释药行为研究及模型拟合

取适量THP-PLGA-NPs冻干粉（含10.0 mg的THP），加入3 mL 1.0% SDS水溶液，置于活化的透析袋中，两端扎紧。取含10 mg THP溶液置于透析袋，同法操作。采用释放介质为1.0% SDS水溶液900 mL，设置溶出试验仪的温度为（37±1）℃，转速为100 r/min，于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h分别取样3 mL，并立即补加空白释放介质3 mL。8500 r/min高速离心30 min后进HPLC测定THP质量浓度，计算含量及各个时间点的累积释放度，结果见图7。THP原料药在4 h内基本释放完毕，累积释放度达到97.19%。THP- PLGA-NPs整个释药过程分为快速释药期和缓慢释药期，在0～6 h时间段释药相对较快，之后表现出明显的缓释特征，48 h内的累积释放度为72.67%。

表13 稳定性试验(, n = 3)

对THP-PLGA-NPs体外释药机制进行拟合，结果见表14。由相关系数可知，THP-PLGA-NPs体外释药符合Higuchi模型：M/∞＝0.112 41/2＋0.078 0，＝0.987 9。

图7 体外释放曲线(, n = 6)

表14 药物释放模型和相关系数

M为¥时累积释放度，M为时间累积释放度，M/M为时间累积释放百分率，为时间

Mis accumulative drug-release at time¥,Mis accumulative drug- release at time,M/Mis accumulative release rate at time,is time

3 讨论

在制备THP-PLGA-NPs时，油相加入到水相的方式如注射器滴加法、直接注入法等对粒径有一定影响，结果显示注射器滴加得到的THP-PLGA-NPs粒径分布更为均匀，PDI值更小。可能是由于注入法对滴速较难控制，导致有机相在水相中分布不均匀，影响了有机相与水相间的溶剂交换过程，从而纳米粒的形成过程产生影响[17]，这点需要研究者加以注意。完全将纳米药物与游离药物分离的难度较大，而且据研究显示[18-19]纳米药物与游离药物之间存在动态平衡，将游离药物分离除去可能会对纳米制剂的稳定性产生不利影响，故本研究不再分离游离药物。

PLGA材料用量对纳米粒包封率、载药量及粒径大小均存在一定影响。一般来讲，载体用量越大，纳米制剂的包封率越高，但过多的载体用量不仅会影响载药量，也会影响体系的黏度，最终导致纳米粒径升高，因此，合适的载体用量是THP-PLGA-NPs的关键因素之一。油水比例也会影响PLGA纳米粒质量，水相比例较大时有助于降低体系黏度，从而使纳米粒更易分散，得到的粒径较小。但较大的水相比例会增加乳化剂用量，使药物因增溶作用进入水相，最终影响纳米制剂的包封率及载药量。当水相过小时，则会造成纳米粒不易分散，从而发生团聚，最终使粒径及PDI增大。

本研究采用的乳化剂泊洛沙姆188具有巨大的空间位阻效应，有助于提高PLGA纳米粒的稳定性，但其质量分数大小也影响着纳米制剂的包封率、载药量及粒径大小。因此，选用PLGA用量、油-水比例和乳化剂质量分数为主要影响因素，采用Box-Behnken响应面法来优化THP-PLGA-NPs处方。

前期研究显示，THP-PLGA-NPs放置稳定性存在较大问题，当直接采用冷冻干燥法制备成冻干粉时，其粒径及PDI值明显变大，且包封率下降明显。可能是由于在冻干过程中随着水分的除去，纳米粒子之间出现聚集、融合等现象，使粒径增加，且分布不规律，最终使粒径及PDI值变大。形成的冰晶也会对纳米粒形成“固化损伤”，导致药物泄露，造成包封率下降[20]。加入保护剂后，可有效阻止纳米粒子聚集，降低或避免“固化损伤”，降低冷冻干燥过程中THP-PLGA-NPs混悬液的脱水速度及皱缩程度，因而THP-PLGA-NPs混悬液制备成冻干粉后稳定性得到较大改善。

本研究分别采用不同质量浓度的乳糖、蔗糖、甘露醇等制备THP-PLGA-NPs的冻干粉。并以冻干粉外观、色泽和分散时间为指标最终筛选出6%甘露醇作为THP-PLGA-NPs冻干剂时效果最佳。这可能是在冻干过程中的升华期或解析期时，甘露醇分子结构中的OH−可与PLGA纳米粒表面形成氢键[21-22]，在逐渐脱水过程中与水分子进行同步交换，最大程度发挥了保护作用。

体外释药研究结果显示，制备的THP-PLGA- NPs体外释药分为快速释药期和缓慢释药期。快速释药阶段可能是由于未包裹进入纳米粒的游离药物所致。另外，分散于纳米粒表面乳化层、浅表层或表层的药物放出去需克服的屏障较少，因而释药相对容易，最终出现了快速释药期。缓慢释药期可能是由于包裹于PLGA纳米粒内部的药物释药出去需克服的屏障相对较多，因而出现了缓慢释药期。这种包含快速释药期和缓慢释药期对药物体内药动学、药效学的影响还需进一步研究。本研究成功制备了粒径约为200 nm的THP-PLGA-NPs，由于载体的包裹作用有助于提高THP的体内稳定性，也为提高药物的生物利用度、改变体内组织分布、降低药物毒副作用、增强药效等奠定了基础[8,23-24]。接下来将开展药动学、药效学等评价，后续将作进一步的科研报道。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 中国药典[S].一部.2020: 145-146.

[2] 王安铸, 马晓昌.延胡索乙素的研究进展 [J].中华中医药杂志, 2020, 35(4): 1927-1929.

[3] 于定荣, 翁小刚, 王本晓, 等.延胡索、白芷炮制配伍对元胡止痛方中延胡索乙素、欧前胡素含量以及镇痛作用的影响 [J].中草药, 2021, 52(8): 2306-2312.

[4] 赵芳, 杨云汉, 赵雪秋, 等.延胡索乙素与β-环糊精及其衍生物的包合行为研究 [J].中草药, 2018, 49(15): 3609-3618.

[5] 李阳杰, 周敬.延胡索乙素纳米结构脂质载体的制备及其药动学行为 [J].中成药, 2019, 41(12): 2990-2993.

[6] 梁卓, 孙艺丹, 王锐利, 等.延胡索乙素在不同溶剂中平衡溶解度及其油水分配系数的测定 [J].中国药物与临床, 2012, 12(8): 984-986.

[7] 邵敬宝, 王群星, 石楠, 等.延胡索总生物碱的急性毒性及其镇痛作用研究 [J].浙江中医药大学学报, 2019, 43(10): 1156-1161.

[8] 高彩芳, 夏加璇, 朱颖, 等.纳米技术在改善中药有效成分成药性中的应用 [J].中草药, 2018, 49(12): 2754-2762.

[9] 李洁丽, 郑春丽, 刘建平, 等.多柔比星PLGA纳米粒的处方工艺优化及体外释药行为研究 [J].药学学报, 2013, 48(5): 759-766.

[10] 王婴, 李木生, 吴瑞婵, 等.星点设计-效应面法优化青藤碱聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的制备工艺 [J].中药新药与临床药理, 2017, 28(2): 232-237.

[11] 管庆霞, 夏昭睿, 王艳宏, 等.包载马钱子碱聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒处方工艺优化及其特性研究 [J].中草药, 2021, 52(4): 951-961.

[12] 陈坚平, 方玉婵, 申楼.熊果酸-PLGA纳米粒的工艺研究及其表征 [J].中药材, 2016, 39(10): 2315-2317.

[13] Rençber S, Aydın Kose F, Karavana S Y.Dexamethasone loaded PLGA nanoparticles for potential local treatment of oral precancerous lesions [J]., 2020, 25(2): 149-158.

[14] Allavena P, Palmioli A, Avigni R,.PLGA based nanoparticles for the monocyte-mediated anti-tumor drug delivery system [J]., 2020, 16(2): 212-223.

[15] 谢青璇, 李小芳, 谢龙, 等.Box-Behnken效应面法优化大黄素/小檗碱-壳聚糖双载药纳米粒的处方工艺研究 [J].中草药, 2021, 52(6): 1614-1622.

[16] 颜洁, 关志宇, 朱卫丰, 等.Box-Behnken效应面法优化自组装法制备葛根素壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒的处方与工艺研究 [J].中草药, 2019, 50(23): 5706-5713.

[17] 李晴宇, 叶晓莉, 陈玲, 等.姜黄素PLGA纳米粒的制备及制剂学性质分析 [J].实用药物与临床, 2016, 19(6): 753-757.

[18] 郝海军, 屈战果, 范明松.隐丹参酮纳米结构脂质载体的制备及药动学研究 [J].中成药, 2020, 42(4): 831-835.

[19] 李超英, 侯世祥, 阳长明, 等.葫芦素毫微粒冻干针剂的研究 [J].中国中药杂志, 2001, 26(5): 315-317.

[20] 吴超群, 李小芳, 牟倩倩, 等.甘草总黄酮纳米混悬剂冻干粉的表征及稳定性考察 [J].中国实验方剂学杂志, 2018, 24(2): 29-33.

[21] 胡瑞瑞, 张家梁, 郝海军.葫芦素B磷脂复合物纳米结构脂质载体的制备 [J].中成药, 2019, 41(11): 2571-2576.

[22] 毛艳婷, 马姝丽, 白朝辉, 等.木犀草素纳米结构脂质载体及其冻干粉的制备和体外释药研究 [J].中国医院药学杂志, 2020, 40(23): 2423-2429.

[23] 李晓婷, 决利利, 郝海军, 等.隐丹参酮纳米混悬剂的制备及其抗肿瘤活性 [J].中成药, 2021, 43(1): 6-10.

[24] 刘会珍, 董丹丹, 范明松.不同厚朴酚制剂的制备、表征及其在SD大鼠体内药动学行为比较 [J].中草药, 2020, 51(17): 4442-4448.

Formulation optimization of THP-PLGA nanoparticles by Box-Behnken design-response surface method andrelease study

YIN Yuan-yuan1, GENG Yan-na1, FAN Ming-song2

1.Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China 2.Technique Center, Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201401, China

To optimize the formulation of tetrahydropalmatine (THP) poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles (THP-PLGA-NPs) by Box-Behnken design-response surface method (BBD-RSM), and carry outevaluation.Nanoprecipitation method was used to prepare THP-PLGA-NPs.Encapsulation efficiency, drug loading, polydispersity index (PDI) and particle size were used as evaluation index, single factor investigation method combined with BBD-RSM to investigate the optimal prescriptions of THP-PLGA-NPs.THP-PLGA-NPs were prepared into lyophilized powder using mannitol as freeze-dried protectors.The optimal formulation was characterized andrelease experiments were also carried out.The optimal formulation: PLGA dosage was 491.8 mg, oil-water volume ratio was 1∶5.2 and surfactant concentration was 1.12%.Envelopment efficiency, drug loading and particle size of THP-PLGA-NPS were (185.07 ± 1.06)%, (4.73 ± 0.21)% and (181.32 ± 7.14) nm, respectively.The results were close to that of predicted values.The drug releasehad obvious sustained-release characteristics, and the release process conformed to the Higuchi model:M/M= 0.112 41/2+ 0.078 0,= 0.987 9.It is feasible to apply BBD-RSM for the formulation optimization of THP-PLGA-NPS, and the optimized PLGA nanoparticles have slow-release effects.

tetrahydropalmatine; PLGA nanoparticles; nanoprecipitation method; prescription optimization; Box-Behnken design- response surface method; sustained-release characteristics;release

R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 6806 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.005

2021-05-14

国家重大新药创制（2018ZX09210090-002-009）；上海市科委项目（21S21903400）

尹元元（1988—），女，硕士，从事中药学研究。Tel: (0371)23906791 E-mail: yinyuan1102@126.com

通信作者：范明松（1973—），男，博士，从事药物研发工作。Tel: (021)51583466 E-mail: msfan007@163.com

[责任编辑 郑礼胜]