枳实薤白桂枝汤对家兔心肌缺血氧化应激损伤的影响*

赵 楠，王秀珍，牟景龙，潘 娟，邸金霖，冯月男，贾洪涛

（1.黑龙江中医药大学实验实训中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

随着社会的发展，人类生活水平的提高，饮食、生活方式及工作压力等多方面因素的影响，冠心病发病率逐年增高，已经成了人类健康的危险因素之一。其中冠状动脉痉挛是引发多种冠心病的重要因素[1-2]。冠状动脉痉挛引起血管一过性收缩或闭塞，导致心肌血氧供应骤然下降，引起心肌缺血，从而进一步损伤心肌细胞[3]。其中氧化应激损伤是导致心脏冠状动脉痉挛的一个重要因素。氧化应激损伤是指机体出现异常时，氧化系统和抗氧化系统失衡，使体内的氧自由基和活性氮自由基过量产出和堆积，机体无法有效清除，从而导致组织损伤[4]。枳实薤白桂枝汤为治疗胸痹之常用方，可通阳散结，祛痰下气，对于胸中痞满，胁气上逆有良好的疗效。现代常应用于冠心病的治疗。本实验探究了家兔冠状动脉痉挛心肌缺血后，枳实薤白桂枝汤对其氧化应激反应的相关指标血清总超氧化物歧化酶（SOD）、血清总抗氧化能力（TAOC）、血清丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及对心脏病理损伤程度的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年CL级家兔共50只，雌雄各半，体质量2.5～3.0 kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（黑）2018-003，使用许可证号：SYXK（黑）2018-007。家兔适应性正常进食进水饲养1周后，通过BL-420F生物技能实验系统剔除心电图Ⅱ导联不正常的家兔，正常家兔用于实验。本实验通过本校伦理委员会批准，无虐杀动物等现象。

1.2 药物 根据《金匮要略》原文记载[6]，枳实薤白桂枝汤药物组成：瓜蒌12 g，枳实12 g，桂枝6 g，厚朴12 g，薤白9 g。以上中药购自安徽天之然药业有限公司。通过水提醇沉法进行枳实薤白桂枝汤药液的提取制备。

1.3 试剂 内皮素1（EDN1，武汉云科隆科技股份有限公司，批号：L180407190）；地尔硫卓（柏雅药业有限公司，批号：AZ-0161206）；氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司，批号：180111）；肝素钠注射液（江苏万邦生物医药股份有限公司，批号：1712013）；GSH分析试剂盒（天津凯通化学试剂有限公司，批号：0170411）；SOD试剂盒（天津凯通化学试剂有限公司，批号：0170331）；MDA试剂盒（天津凯通化学试剂有限公司，批号：0170421）；TAOC测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：0180411）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120）。

1.4 主要仪器LDZ4-1.2型台式离心机（北京医用离心机厂）；BL-420F型生物技能实验系统（成都盟泰科技有限公司）；狗兔两用解剖台（张家港生物医学仪器厂）；酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；CX23型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.5 造模与分组 将50只家兔随机分为模型组、枳实薤白桂枝汤低剂量组、枳实薤白桂枝汤中剂量组、枳实薤白桂枝汤高剂量组、地尔硫卓组，每组10只。造模前各组家兔分别灌胃给药5 d，进行药物适应预处理，在末次灌胃60 min后造模。本实验根据吴以岭方法[5]，通过家兔耳缘静脉注射EDN1诱导家兔发生心脏冠状动脉痉挛。首先按照家兔的体质量比例，给予家兔5 mL/kg氨基甲酸乙酯缓慢推注进行药物麻醉，观察家兔状态，当家兔出现角膜反射迟钝，四肢瘫软等相应症状时，麻醉完成准备手术。给予家兔颈部备皮消毒后，剪开皮肤组织，暴露颈静脉后插管，用手术线结扎，以备实验获取待测血清。术前调试生物技能系统，各项参数设置完毕后，备用。将调试好的生物技能系统电极片连接于家兔四肢，记录家兔Ⅱ导联心电图，约0.5 h心电图稳定后，按家兔体质量比例弹入式注射1.4 nmol/kg EDN1药液。Ⅱ导联心电图出现T波高尖，ST段明显抬高即为造模成功。

1.6 实验给药 经参照，汉代1 L换算成现代为200 mL，临床常用剂量认为1剂中药可煎取约300 mL药液，内含有51 g生药，人体每次服药约100 mL，内含生药17 g。按体质量为70 kg计算，人体正常每次服药剂量为0.24 g/kg。故将提取的药液浓缩至生药17 g/100 mL。参照实验动物用药剂量进行换算，实薤白桂枝汤低、中、高剂量分别为0.395、0.790、1.580 g/kg，地尔硫卓剂量为5 mg/kg。各组家兔在制备模型前进行灌胃预处理，3次/d，连续5 d，枳实薤白桂枝汤低、中、高剂量组和地尔硫卓组家兔灌胃相应药物；模型组灌胃等体积的生理盐水。

1.7 观察指标

1.7.1 血清氧化应激水平5组家兔分别进行4次采血，每次采血量为5 mL，4次时间点分别为造模前、造模后0.5 h、造模后2 h、造模后6 h，在采血后进行高速离心分离血清，随后将分离出的血清装入消毒后的离心管中，低温保存，待测备用。严格按照化学定量检测试剂盒和ELISA试剂盒的检测方法对血清中SOD、TAOC、MDA、GSH水平进行检测。

1.7.2 心肌组织病理改变情况 在注射EDN1药液造模6 h时，家兔耳缘静脉注射肝素钠防止凝血，3 min后颈动脉放血，迅速开胸取心，修剪心脏周围脂肪血管等多余组织，仅保留心脏右心室，在4℃的条件下，用含4%的多聚甲醛磷酸缓冲固定液将右心室组织静置24 h，随后制作切片用于HE染色，观察心肌组织病理损伤的程度。

1.8 统计学方法 应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔血清中SOD活性水平比较 不同注射时间（0.5、2、6 h）之间家兔血清中SOD活性水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应；模型组和枳实薤白桂枝汤低、中、高剂量组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中SOD活性水平随时间延长均逐渐降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；地尔硫卓组家兔注射后0.5 h血清中SOD活性水平低于注射前（P＜0.05），注射后2、6 h血清中SOD活性水平与注射后0.5 h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。5组家兔血清中SOD活性水平总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应；注射前，地尔硫卓组和枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中SOD活性水平高于模型组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中SOD活性水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；注射后，地尔硫卓组和枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中SOD活性水平均高于模型组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中SOD活性水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中SOD活性水平低于地尔硫卓组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中SOD活性水平与地尔硫卓组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。时间因素和分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表1、图1）

图1 各组家兔各时间点血清中SOD活性水平变化趋势图

表1 各组家兔SOD活性水平的比较（±s，U/mg）

表1 各组家兔SOD活性水平的比较（±s，U/mg）

注：F时间主效应=68.399，P时间主效应=0.000；F分组主效应=5.622，P分组主效应=0.001；F交互效应=3.436，P交互效应=0.000；与模型组比较，aP＜0.05；与地尔硫卓组比较，bP＜0.05；与注射前比较，cP＜0.05；与0.5 h比较，dP＜0.05；与2 h比较，eP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(g/kg) 注射前 注射后0.5 h 注射后2 h 注射6 h F P模型组 10 -枳实薤白桂枝汤低剂量组10 0.395枳实薤白桂枝汤中剂量组10 0.790枳实薤白桂枝汤高剂量组10 1.580地尔硫卓组 10 0.005 F 4.157 5.705 5.839 7.234 P 0.006 0.001 0.001 0.000 181.67±65.71 192.73±67.51b 278.10±72.86a 290.13±81.08a 285.33±117.55a 148.17±60.43c 156.25±55.91b c 259.83±69.44a c 261.58±80.94a c 222.54±90.39a c 141.61±53.49c 140.47±54.15b c d 234.33±46.32a c d 249.82±79.99a c d 224.46±98.12a c 126.42±50.75c d e 127.94±52.22b c d e 217.93±46.57a c d e 248.23±73.48a c d 210.56±92.65a c 45.875 0.000 17.042 0.001 12.521 0.003 71.687 0.000 17.474 0.001

2.2 各组家兔血清中TAOC活性水平比较 不同注射时间（0.5、2、6 h）之间家兔血清中TAOC活性水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应；模型组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中TAOC活性水平均低于注射前（P＜0.05），但注射后（0.5、2、6 h）血清中TAOC活性水平之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中TAOC活性水平随时间延长均逐渐降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔注射后0.5 h血清中TAOC活性水平与注射前比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但注射后2、6 h血清中TAOC活性水平逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。5组家兔血清中TAOC活性水平总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应；注射前，地尔硫卓组和枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中TAOC活性水平均高于模型组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中TAOC活性水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；注射后，枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔在注射后血清中TAOC活性均高于模型组（P＜0.05），地尔硫卓组家兔血清中TAOC活性高于模型组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中TAOC活性水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔注射后6 h血清中TAOC活性水平低于地尔硫卓组（P＜0.05），枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中TAOC活性水平均高于地尔硫卓组（P＜0.05）。时间因素和分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表2、图2）

表2 各组家兔TAOC活性水平的比较（±s，U/mg）

表2 各组家兔TAOC活性水平的比较（±s，U/mg）

注：F时间主效应=139.890，P时间主效应=0.000；F分组主效应=29.093，P分组主效应=0.000；F交互效应=5.581，P交互效应=0.000；与模型组比较，aP＜0.05；与地尔硫卓组比较，bP＜0.05；与注射前比较，cP＜0.05；与0.5 h比较，dP＜0.05；与2 h比较，eP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(g/kg) 注射前 注射后0.5 h 注射后2 h 注射后6 h F P模型组 10 -枳实薤白桂枝汤低剂量组10 0.395枳实薤白桂枝汤中剂量组10 0.790枳实薤白桂枝汤高剂量组10 1.580地尔硫卓组 10 0.005 F 38.884 30.488 20.879 18.328 P 0.000 0.000 0.000 0.000 11.49±2.35 10.84±3.27b 34.84±11.23ab 47.63±9.98ab 22.39±8.87a 9.16±2.17c 9.23±2.81 27.69±8.30abc 39.36±11.57abc 15.95±8.05ac 8.17±1.68c 7.18±3.03cd 23.25±7.75abcd 30.53±12.30abcd 12.77±4.86cd 5.81±1.77c 6.66±2.48bcd 19.37±7.18abcde 25.57±11.54abcde 9.64±3.36cde 143.556 0.000 76.299 0.000 38.682 0.000 121.031 0.000 75.007 0.000

图2 各组家兔各时间点血清中TAOC活性水平变化趋势图

2.3 各组家兔血清中MDA含量比较 不同注射时间（0.5、2、6 h）之间家兔血清中MDA含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应；模型组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中MDA含量均高于注射前，且随时间延长均逐渐升高（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤高剂量组和地尔硫卓组家兔注射后0.5 h血清中MDA含量均高于注射前，注射后2、6 h血清中MDA含量均高于注射前，但低于注射后0.5 h，差异均有统计学意义（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤中剂量组家兔注射后0.5、2、6 h血清中MDA含量均高于注射前（P＜0.05），且注射后2 h血清中MDA含量低于注射后0.5 h（P＜0.05）。5组家兔血清中MDA含量总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应；注射前，5组家兔血清中MDA含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；枳实薤白桂枝汤中剂量组家兔注射后0.5 h血清中MDA含量高于模型组（P＜0.05）；地尔硫卓组和枳实薤白桂枝汤低、高剂量组家兔血清中MDA含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中MDA含量高于地尔硫卓组（P＜0.05）；地尔硫卓组和枳实薤白桂枝汤中、高剂量组注射后2、6 h家兔血清中MDA含量均明显低于模型组（P＜0.05），且3组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中MDA含量均明显高于地尔硫卓组（P＜0.05），且与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。时间因素和分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表3、图3）

表3 各组家兔血清中MDA含量比较（±s，nmol/mg）

表3 各组家兔血清中MDA含量比较（±s，nmol/mg）

注：F时间主效应=145.011，P时间主效应=0.000；F分组主效应=5.677，P分组主效应=0.001；F交互效应=11.505，P交互效应=0.000；与模型组比较，aP＜0.05；与地尔硫卓组比较，bP＜0.05；与注射前比较，cP＜0.05；与0.5 h比较，dP＜0.05；与2 h比较，eP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(g/kg)注射前 注射后0.5 h注射后2 h 注射后6 h F P模型组 10 -枳实薤白桂枝汤低剂量组10 0.395枳实薤白桂枝汤中剂量组10 0.790枳实薤白桂枝汤高剂量组10 1.580地尔硫卓组 10 0.005 F 1.079 6.477 5.699 10.198 P 0.378 0.000 0.001 0.000 2.87±1.84 3.51±1.84 2.20±0.66 3.27±1.14 3.28±1.93 9.71±3.21c 11.11±3.81b c 5.06±1.02a c 7.11±2.33c 7.62±3.38c 10.70±3.03c d 9.95±3.69b c d 4.60±0.7a c d 6.13±2.24a c d 5.88±3.76a c d 11.36±3.48c d e 9.00±3.86b c d e 4.82±0.52a c 5.59±1.23a c d 6.30±2.68a c d 53.528 0.000 43.498 0.000 59.011 0.000 63.795 0.000 45.492 0.000

2.4 各组家兔血清中GSH活性水平比较 不同注射时间（0.5、2、6 h）之间家兔血清中GSH活性水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应；模型组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中GSH活性水平均低于注射前（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔注射后（0.5、2、6 h）血清中GSH活性水平逐渐降低，均低于注射前（P＜0.05），且注射后2、6 h血清中GSH活性水平低于注射后0.5 h（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤中剂量组和地尔硫卓组家兔注射后0.5、2、6 h血清中GSH活性水平均低于注射前（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤高剂量组家兔注射后血清中GSH活性水平出现先降低后升高再降低趋势，且各时间点间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。5组家兔血清中GSH活性水平总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应；注射前，枳实薤白桂枝汤低剂量组和地尔硫卓组家兔血清中GSH活性水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），枳实薤白桂枝汤中、高剂量组家兔血清中GSH活性水平均高于模型组（P＜0.05）。注射后，枳实薤白桂枝汤中、高剂量组和地尔硫卓组家兔血清中GSH活性水平均高于模型组（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔注射后0.5、2 h血清中GSH活性水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），注射后6 h血清中GSH活性水平低于模型组（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔血清中GSH活性水平低于地尔硫卓组（P＜0.05）；枳实薤白桂枝汤高剂量组家兔血清中GSH活性水平高于地尔硫单组（P＜0.05）。时间因素和分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表4、图4）

表4 各组血清中家兔GSH活性水平比较（±s，U/mg）

表4 各组血清中家兔GSH活性水平比较（±s，U/mg）

注：F时间效应=263.033，P时间效应=0.000；F分组效应=22.194，P分组效应=0.000；F交互效应=9.151，P交互效应=0.000；与模型组比较，aP＜0.05；与地尔硫卓组比较，bP＜0.05；与注射前比较，cP＜0.05；与0.5 h比较，dP＜0.05；与2 h比较，eP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(g/kg) 注射前 注射后0.5 h 注射后2 h 注射后6 h F P模型组 10 -枳实薤白桂枝汤低剂量组10 0.395枳实薤白桂枝汤中剂量组10 0.790枳实薤白桂枝汤高剂量组10 1.580地尔硫卓组 10 0.005 F 25.996 19.091 21.957 17.963 P 0.000 0.000 0.000 0.000 727.67±138.84 619.18±153.67 945.88±110.10a b 1 270.38±215.08a b 683.65±185.04 446.86±130.91c 374.17±164.62b c 686.21±119.77a c 859.76±115.56a b c 620.18±161.56a c 431.58±142.23c 334.44±169.31b c d 607.79±94.74a c d 882.50±119.28a b c 570.57±163.54a c d 434.09±133.28c 306.92±171.58a b c d 575.59±93.35a c d e 807.31±111.26a b c d e 501.10±167.90c d e 148.784 0.000 145.202 0.000 112.004 0.000 38.794 0.000 17.505 0.001

图4 各组家兔各时间点血清中GSH活性水平变化趋势图

2.5 各组家兔心肌组织病理改变情况 模型组家兔心肌组织纤维结构出现排列混乱，间质可见水肿，部分纤维组织坏死，伴有炎症细胞浸润；枳实薤白桂枝汤低剂量组家兔心肌组织变化与模型组相似；枳实薤白桂枝汤中、高剂量组和地尔硫卓组家兔心肌组织纤维断裂及排列混乱程度减轻，心肌间质水钟程度减轻，炎症细胞明显减少。（见图5）

图5 各组家兔心肌病理改变情况（HE，×400）

3 讨 论

“胸痹”首见于《灵枢·本脏》，将胸痹分为“心痹”与“肺痹”两大类[7]。直至汉代张仲景在《金匮要略》中对“胸痹”的概念、病因病机及治法证候等有了详细论述并创立栝楼薤白类方剂治疗胸痹心痛[8-9]。其中“胸痹心中痞气，气结在胸，胸满，胁下逆抢心，枳实薤白桂枝汤主之。”枳实薤白桂枝汤治以通阳散结，祛痰下气。此方由枳实、薤白、桂枝、瓜蒌、厚朴组成，方中瓜蒌味甘性寒，涤痰散结，开胸通痹;薤白辛温，通阳散结，化痰散寒，能散胸中凝滞之阴寒、化上焦结聚之痰浊、宣胸中阳气以宽胸，为疗胸痹之要药，二者共为君药。枳实下气破结，消痞除满;厚朴燥湿化痰，下气除满，二者可助君药宽胸散结、下气除满、通阳化痰之效，均为臣药；方中佐以桂枝通散寒，降逆平冲。本方药简力专，为治疗冠心病的经典方剂。

近年来，枳实薤白桂枝汤在治疗冠心病的临床疗效中具有一定的优势。研究表明[10]，枳实薤白桂枝汤加减运用对痰浊内阻型冠心病不稳定型心绞痛具有一定疗效，同时可降低同型半胱氨酸(Hcy)和C反应蛋白（CRP）的水平。枳实薤白桂枝汤加味联合西药可有效的缓解胸阳不振、痰阻心脉患者的临床症状，有效降低患者心绞痛发作的频率并改善血脂水平[11]。枳实薤白桂枝汤联合曲美他嗪片对治疗急性心肌梗死患者有显著效果，且未增加不良反应[12]。现代药理研究表明，枳实薤白桂枝汤可使离体家兔左心室舒张末压（LVEDP）降低，左室收缩压（LVSP）、+dp/dtmax、-dp/dtmax在等时间点时升高，表明枳实薤白桂枝汤在心肌缺血缺氧时对心脏泵血功能障碍具有一定的改善作用[13]。枳实薤白桂枝汤对家兔冠状动脉痉挛引起的心肌缺血具有一定的保护作用[14]。由此可知，枳实薤白桂枝汤对心肌缺血诱发的冠心病具有一定的疗效，其具体治疗机制应进一步研究。

氧化应激反应在心肌缺血再灌注损伤中扮演重要的角色，对心肌细胞的损伤起到重要的作用。其是指体内的抗氧化能力与氧化体系相对失衡，导致抗氧化能力下降，导致中性粒细胞炎性浸润，氧自由基大量堆积，产生大量的氧化产物。与此同时，导致蓄积的大量活性氧与心肌组织的脂质体发生反应，产生大量MDA，所以MDA是评价氧化损伤和机体氧化活性的重要指标[15]。SOD可有效对抗氧自由基，避免过氧化和自由基的损伤，促进细胞组织损伤的修复。TAOC水平的改变可反映机体抗氧化损伤的防御能力，是氧化防御体系的重要部分。GSH作为机体的重要的抗氧化剂和自由基清除剂，其活性的变化具有重要意义。因此，心肌细胞GSH、SOD、TAOC、MDA水平的改变反映了机体抗自由基的能力[16]。本实验通过观察各组家兔在注射EDN1前、注射后0.5 h、注射后2 h、注射后6 h血清GSH、SOD、TAOC、MDA水平的改变，以及心脏病理损伤程度，发现枳实薤白桂枝汤可使GSH、SOD、TAOC活性水平提高，MDA水平降低，且枳实薤白桂枝汤中、高剂量组提升GSH、TAOC能力优于地尔硫卓组。

综上所述，枳实薤白桂枝汤可有效干预氧化应激损伤，其对冠状动脉痉挛引起的心肌缺血具有一定的保护作用，可有效改善家兔心脏损伤，其抗氧化应激损伤机制可能与调节血管内细胞的代谢产物，激活氧化应激的相关信号通路相关，其确切机制有待于进一步研究。