桃红四物汤对大鼠肢体缺血-再灌注损伤骨骼肌Wnt5a信号表达的影响*

李武平，李 婕，易 南，黄思琦，刘宗义，朱付平

（1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 湖南 410007；2.湖南中医药大学，长沙 湖南 410208）

肢体缺血-再灌注损伤（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢体缺血损伤和再灌注损伤的合称，其常继发于动脉损伤、动脉栓塞、断肢再植、带血管蒂组织移植、骨筋膜室综合征、重建手术、不当止血带应用等方面。自1985年Mc Cord提出缺血-再灌注损伤的概念后[1]，逐渐被学术界公认并不断地深入研究，相较于对心、肝、脑、肾等重要器官缺血-再灌注损伤的研究方面，学术界对骨骼肌缺血-再灌注损伤的研究相对较少，然而骨骼肌对缺血十分敏感，文献报道显示阻断肢体血流2.5 h后复灌就会引起肢体缺血-再灌注损伤[2]。LIRI可致肢体骨骼肌坏死挛缩而致残，严重者甚至引起全身多器官功能衰竭而致死亡[3]。医学界多认为其与脂质过氧化、氧自由基损伤、钙离子代谢紊乱、细胞凋亡、炎症反应损害等有关，但LIRI的分子病理机制尚不明确，亦缺乏特异并且有效的治疗方法[4-5]。我们前期研究发现，Wnt/Ca2+信号通路在大鼠LIRI钙离子代谢及炎症反应方面起着至关重要的作用[6]。桃红四物汤源自清代吴谦《医宗金鉴》，是活血化瘀经典方剂之一，临床上也常用于各种严重创伤所致潜在LIRI风险，并取得了满意疗效[7]。课题组前期研究显示桃红四物汤预处理可减少大鼠LIRI骨骼肌细胞凋亡[8]，同时体外细胞实验研究发现，经缺氧再给氧诱导损伤的大鼠骨骼肌细胞中，Wnt5a、IP3R、CaMKⅡ等蛋白表达明显上调，而桃红四物汤预处理后可以通过调控Wnt/Ca2+信号通路Wnt5a/IP3R/CaMKⅡ途径来减轻肢体缺血-再灌注损伤[9]。Wnt5a作为Wnt信号通路中重要的上游信号分子，在大鼠体内的表达变化情况值得进一步研究，因此本研究制备LIRI骨骼肌损伤大鼠模型，以Wnt5a阻滞剂作为阳性对照，观察桃红四物汤干预对Wnt5a表达变化的影响，从Wnt/Ca2+信号通路角度进一步探讨大鼠LIRI骨骼肌损伤机制及桃红四物汤的干预机制，旨在为丰富LIRI的病理机制和防治方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄SPF级SD雄性大鼠100只，体质量（230±10）g，购自湖南长沙SLAC景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0002。大鼠在湖南中医药大学实验动物中心的无病原体设施中常规饲料饲养，自由饮水，饲养环境为温度20～25℃、相对湿度50%～70%，光照12 h。本实验已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查，伦理审查批号：HN-LL-GZR-201609；动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2 药物与试剂 桃红四物汤，方药组成：桃仁15 g，红花15 g，熟地黄10 g，赤芍10 g，当归10 g，川芎10 g，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科结合现代工艺加工制成药液，规格：250 mL/瓶，质量浓度：0.15 g/mL原料药，批号：20160408；FZR5（美国Sigma公司，批号：20160206，规格：20 μg/mL）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京索来宝科技有限公司，批号：T1350）；抗Wnt5a（北京博奥森生物技术有限公司，批号：BS4773）；Trizol[爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司，批号：15596-026]；Rever Tra Ace qPCR RT试剂盒（东洋纺上海生物科技有限公司，批号：FSQ101）；SYBRPremix Ex TaqTM（perfect real-time）试剂盒（大连宝生物工程公司，批号：DRR420A）；大鼠IL-1β ELISA检测试剂盒（批号：ab100772）、大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（批号：ab100785）（英国Abcam公司）。

1.3 主要仪器GL16M台式高速冷冻离心机（长沙科威实业有限公司，型号：TGL20M）；BD-180S双门冷冻柜（青岛海尔冰箱通用有限公司，型号：BC/BD-318HD）；NIS Elements F3.0软件（日本东京尼康，型号：AR/BR/D）；Image Pro plus version 6.0（美国Media Cybernetics公司）；酶标仪（上海培奥分析仪器有限公司，型号：PO-9622A）；7500实时PCR扩增仪（美国ABI公司，型号：7500）。

1.4 动物分组与造模 将100只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤高剂量组、阻滞剂组，每组20只。除正常组大鼠不阻断血流外，其他4组均根据课题组前期造模方法[10]，用塑料套管和市售橡皮筋阻断SD大鼠右后肢血流4 h后，再解除阻断恢复下肢血流灌的注，制备大鼠肢体缺血-再灌注损伤模型；阻断大鼠后肢血流4 h后，大鼠趾掌变得苍白青紫、发凉，挤压足趾无毛细血管充盈反应，患肢主动活动明显受限，被动牵拉患肢大鼠挣扎躲避，提示造模成功。

1.5 实验给药 桃红四物汤低、高剂量组大鼠于造模前3 d开始灌胃给予桃红四物汤，2次/d，造模前2 h再给药1次，每只大鼠给药共7次，具体给药剂量根据所测体质量通过体表面积-剂量换算法，计算得出大鼠每天桃红四物汤的等效剂量为1.35 g/kg，FZR5大鼠的等效剂量为87 μg/kg；桃红四物汤低、高剂量分别设置为等效剂量的1、2倍，即桃红四物汤低剂量组大鼠每日给药剂量为1.35 g/kg，桃红四物汤高剂量组为2.70 g/kg，阻滞剂组在造模前2 h予以腹腔注射FZR5，87 μg/kg；正常组和模型组大鼠在同样的时间点给予相同体积蒸馏水灌胃。

1.6 观察指标 在缺血再灌注0、2、4、8 h 4个时间点，各组随机选取5只大鼠，3%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定在自制大鼠手术台上，右侧后肢相应的区域剪毛，复合碘消毒，沿右侧后肢长轴方向依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜，充分显露腓肠肌肌腹组织，切取腓肠肌100 mg，迅速冰盐水洗净血液，滤纸吸干水分，剪刀切割剪碎后装入保存管，置于低温冰箱（-70℃）保存。

1.6.1 HE染色法行组织病理学观察 取复灌后8 h大鼠部分腓肠肌组织切片，用4%中性甲醛溶液固定，石蜡切片（4 μm）苏木精染液染色，0.5%冰盐酸-酒精分化液分化，梯度酒精脱水，50%伊红液染色，梯度酒精脱水、二甲苯使切片透明后晾干，中性树胶封片，盖片，显微镜下观察各组大鼠腓肠肌病理损伤情况并拍照记录。

1.6.2 ELISA法检测腓肠肌IL-1β、TNF-α含量 取不需要组织学检查的部分腓肠肌组织，转移到匀浆机中，暴露于蛋白质提取液中，在冰浴下匀浆，移入离心管中，15 000 r/min离心30 min，除去沉淀，取上清液于-20℃下保存，分析。取100 μL的样品，参考TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒操作步骤，在酶标仪上进行检测，取波长450 nm，空白孔校零后，读取各孔OD值。

1.6.3 RT-qPCR法检测腓肠肌Wnt5a mRNA表达 使用Trizol试剂盒、氯仿和异丙醇等试剂，完成总RNA的提取、清洗、溶解、定量及鉴定；用寡核苷酸18引物和M-MLV逆转录酶逆转录2 μg总RNA以获得cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH为内参，根据溶解曲线证实引物的特异性和结果的可信度，使用2-ΔΔCT测定靶基因的相对表达量。其中ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct，ΔΔCt=对照组ΔCt-样品组ΔCt。引物序列见表1。

表1 基因RT-qPCR引物信息

1.6.4 免疫组化法检测腓肠肌Wnt5a蛋白的阳性表达 提取复灌后8 h的大鼠腓肠肌组织，多聚甲醛固定并切片，3%过氧化氢（H2O2）处理，并与10%山羊血清预孵育，然后与抗Wnt5a（1∶100）抗体在4℃孵育后，用HRP标记的IgG孵育样品，用二氨基联苯胺（DAB）进行显色反应，在显微镜下观察显色过程。使用NIS Elements F 3.0软件在200倍放大的光学显微镜下观察显色过程并采集图像。用Image Pro plus version 6.0单盲法测量Wnt5a阳性表达处的积分光密度（IA）值。

1.7 统计学方法 数据应用SPSS 21.0软件包进行统计分析，计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，IL-1β、TNF-α、Wnt5a mRNA表达数据为符合正态分布及方差齐的计量资料，采用重复测量资料方差分析；Wnt5a蛋白表达数据为符合正态分布及方差齐的计量资料，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠腓肠肌病理结果比较 本实验所有大鼠在观察时间窗内均无死亡，正常组大鼠可见腓肠肌肌纤维呈长索状，肌纤维排列整齐，结构清晰，肌浆丰富，每一肌纤维内表面有多个紧密附着的细胞核，胞核大小均匀，着色均匀；模型组大鼠可见腓肠肌肌纤维紊乱、肿胀，大部分肌纤维完整性、连续性遭到破坏，细胞核散在稀疏，肌纤维间明显炎症细胞浸润；阻滞剂组、桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤高剂量组大鼠大部分腓肠肌肌纤维结构完整、排列整齐，部分肌纤维轻度破坏变薄，部分肌纤维间缝隙增宽，少量炎症细胞浸润。（见图1）

图1 各组大鼠腓肠肌染色形态光镜图（HE，×100）

2.2 各组大鼠腓肠肌中IL-1β含量比较 不同再灌注时间（0、2、4、8 h）之间大鼠腓肠肌中IL-1β含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不存在时间效应。模型组大鼠腓肠肌中IL-1β含量呈逐渐上升的趋势，再灌注8 h达到峰值（P＜0.05）；桃红四物汤低剂量组大鼠腓肠肌中IL-1β含量呈逐渐下降的趋势，再灌注8 h为最低值（P＜0.05）；阻滞剂组大鼠腓肠肌中IL-1β含量呈先升高后降低，然后再升高的变化趋势，再灌注2 h达到峰值（P＜0.05）。5组大鼠腓肠肌中IL-1β含量总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应。模型组大鼠腓肠肌中IL-1β含量高于正常组（P＜0.05）；阻滞剂组、桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中IL-1β含量均低于模型组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中IL-1β含量均低于桃红四物汤低剂量组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中IL-1β含量低于阻滞剂组（P＜0.05）。时间因素与分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表2、图2）

表2 各组大鼠腓肠肌中IL-1β含量比较（±s，pg/mL）

表2 各组大鼠腓肠肌中IL-1β含量比较（±s，pg/mL）

注：F交互效应=16.088，P交互效应=0.000；F时间主效应=0.921，P时间主效应=0.434；F组别主效应=3412.524，P组别主效应=0.000；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桃红四物汤低剂量组比较，cP＜0.05；与阻滞剂组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常组 5 - 134.26±1.65 134.03±3.69 136.83±5.66 137.53±9.27 1.249 0.298模型组 5 - 256.06±5.87a 261.13±3.26a 270.18±0.99a 272.17±3.81a 22.662 0.000桃红四物汤低剂量组5 1.35 218.53±0.72ab 213.94±1.21ab 208.36±3.04ab 197.96±2.43ab 30.845 0.000桃红四物汤高剂量组5 2.70 181.47±2.89abcd 183.85±2.06abcd 187.37±2.24abcd 185.55±0.64abcd 2.473 0.068阻滞剂组 5 8.70×10-5 202.53±0.32ab 206.94±3.10ab 195.98±2.88ab 200.95±2.56ab 8.045 0.000 F 800.653 844.414 900.202 915.520 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图2 IL-1β的交互效应轮廓图

2.3 各组大鼠腓肠肌中TNF-α含量比较 不同再灌注时间（0、2、4、8 h）之间大鼠腓肠肌中TNF-α含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应，5组均如此。正常组、模型组大鼠腓肠肌中TNF-α含量再灌注后逐渐上升，再灌注4 h达到峰值，然后均呈下降趋势（P＜0.05）；桃红四物汤低剂量组大鼠腓肠肌中TNF-α含量呈逐渐下降的趋势，再灌注8 h为最低值（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中TNF-α含量呈逐渐升高的趋势，再灌注8 h达到峰值（P＜0.05）；阻滞剂组大鼠腓肠肌中TNF-α含量再灌注后逐渐下降，再灌注2 h达到最低值，然后呈上升趋势，再灌注8 h达到峰值（P＜0.05）。5组大鼠腓肠肌中TNF-α含量总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应。模型组大鼠腓肠肌中TNF-α含量高于正常组（P＜0.05）；桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤高剂量组、阻滞剂组大鼠腓肠肌中TNF-α含量均低于模型组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中TNF-α含量低于桃红四物汤低剂量组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中TNF-α含量低于阻滞剂组（P＜0.05）。时间因素与分组因素间存在交互效应（P＜0.05）。（见表3、图3）

表3 各组大鼠腓肠肌中TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

表3 各组大鼠腓肠肌中TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

注：F交互效应=17.067，P交互效应=0.000；F时间主效应=11.319，P时间主效应=0.000；F组别主效应=2202.912，P组别主效应=0.000；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桃红四物汤低剂量组比较，cP＜0.05；与阻滞剂组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常组 5 - 78.95±0.53 81.58±1.43 82.85±0.72 81.58±0.36 4.253 0.008模型组 5 - 125.30±0.41a 128.99±6.86a 134.45±2.53a 131.47±1.67a 23.725 0.000桃红四物汤低剂量组5 1.35 112.32±0.32a b 109.17±0.67a b 106.57±0.71a b 102.11±0.85a b 29.451 0.000桃红四物汤高剂量组5 2.70 86.29±055a b c d 88.22±0.37a b c d 91.73±0.19a b c d 93.83±0.56a b c d 18.228 0.000阻滞剂组 5 8.70×10-5 101.84±0.19a b 101.71±0.38a b 103.07±0.38a b 105.11±0.97a b 3.929 0.011 F 562.483 548.380 605.970 537.279 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 TNF-α的交互效应轮廓图

2.4 各组大鼠腓肠肌Wnt5a mRNA表达比较 不同再灌注时间（0、2、4、8 h）之间大鼠腓肠肌Wnt5a mRNA表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应。除正常组外，其余各组大鼠再灌注后腓肠肌Wnt5a mRNA表达均逐渐上升。5组大鼠腓肠肌Wnt5a mRNA表达总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应。与正常组比较，模型组、阻滞剂组、桃红四物汤高剂量组、桃红四物汤低剂量组大鼠腓肠肌中Wnt5a mRNA表达上调（P＜0.05）；与模型组比较，阻滞剂组、桃红四物汤高剂量组、桃红四物汤低剂量组大鼠腓肠肌中Wnt5a mRNA表达下调（P＜0.05）；与桃红四物汤低剂量组比较，桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中Wnt5a mRNA表达下调（P＜0.05）；与阻滞剂比较，桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌中Wnt5a mRNA表达下调（P＜0.05）。时间因素和组别因素存在交互效应（P＜0.05）。（见表4、图4～5）

表4 各组大鼠腓肠肌Wnt5a mRNA表达比较（±s）

表4 各组大鼠腓肠肌Wnt5a mRNA表达比较（±s）

注：F交互效应=8.209，P交互效应=0.000；F时间主效应=73.943，P时间主效应=0.000；F组别主效应=555.844，P组别主效应=0.000；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桃红四物汤低剂量组比较，cP＜0.05；与阻滞剂组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常组 5 - 28.53±0.16 28.92±0.95 28.72±0.58 27.92±1.22 0.680 0.567模型组 5 - 41.56±1.56a 43.42±1.37a 45.36±1.12a 49.34±1.26a 40.342 0.000桃红四物汤低剂量组5 1.35 38.13±1.17ab 40.36±1.23ab 42.63±0.89ab 45.16±1.15ab 33.138 0.000桃红四物汤高剂量组5 2.70 36.83±1.31abcd 38.61±1.72abcd 40.32±0.93abcd 42.73±1.84abcd 10.158 0.000阻滞剂组 5 8.70×10-5 37.32±1.07ab 39.26±1.22ab 40.87±1.36ab 43.18±1.27ab 22.461 0.000 F 84.295 108.692 148.226 239.257 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图4 Wnt5a mRNA的交互效应轮廓图

图5 各组Wnt5a/GAPDH的扩增与溶解曲线图

2.5 各组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达比较 模型组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达明显高于正常组（P＜0.05）；阻滞剂组、桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达明显低于桃红四物汤低剂量组（P＜0.05）；桃红四物汤高剂量组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达与阻滞剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图6、表5）

图6 各组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达（IHC，×200）

表5 各组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠腓肠肌Wnt5a蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桃红四物汤低剂量组比较，cP＜0.05；与阻滞剂组比较，dP＞0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[g/(kg·d)]Wnt5a表达积分光密度值（IA值）正常组 5 - 9.10±0.94模型组 5 - 28.36±2.65a桃红四物汤低剂量组5 1.35 17.82±1.38ab桃红四物汤高剂量组5 2.70 13.45±1.75abcd阻滞剂组 5 8.70×10-5 12.55±2.05ab F 96.337 P 0.000

3 讨 论

LIRI的机理极为复杂，就目前的研究成果看，肢体缺血-再灌注损伤的病理机制是能量代谢障碍、兴奋性神经递质毒效应、钙超载等导致组织细胞结构和功能障碍，以及引发大量自由基和一些促炎性细胞因子爆发释放，如NF-κB、IL-1β、TNF-α等，从而引起全身炎症反应[4]。中医学中虽无“LIRI”病名的记载，但根据其病变的临床表现（主要为肿胀、疼痛、组织坏死等），以及目前对骨筋膜室综合征、断肢再植术后、动脉栓塞等肢体缺血-再灌注损伤疾病的中医病因病机分析和认知，LIRI当属于“股肿”“脉痹”等范畴，病机多集中在瘀血内阻，气血运行不畅等方面，证属“气滞血瘀”，而治则以“通行血脉”“化瘀消肿”为法。桃红四物汤为活血化瘀的代表方，方中桃仁、红花活血化瘀；熟地黄、当归甘温，滋补肝肾之阴，养血调经，通达气机；川芎行气活血，调畅气血，以助活血之功，使气行以达血行[11]。全方以活血化瘀为主，配合滋补肝肾，条达气机，行气活血，消肿止痛，使瘀血祛，新血生，共奏气通、血活、肿消、痛减之功效。因而，桃红四物汤广泛应用于缺血-再灌注损伤疾病的防治，如桃红四物汤能够抑制脑缺血-再灌注损伤后大鼠大脑皮质神经元Caspase-3与p53的表达，从而减轻脑细胞的凋亡[12]；也有学者[13]从基因传导通路方面证实桃红四物汤对大鼠脑缺血-再灌注损伤具有保护作用。在肾脏缺血-再灌注损伤方面，桃红四物汤可通过抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠肾脏功能[14]；在肢体缺血-再灌注损伤疾病方面，有研究显示桃红四物汤加减可改善四肢骨折术后患者血清炎症因子水平，减轻四肢骨折肢体肿胀程度，可有效预防骨筋膜室综合征形成[7]；有学者使用桃红四物汤干预家兔早期骨筋膜室综合征模型，发现桃红四物汤能上调早期骨筋膜室综合征模型家兔血清SOD含量，抑制氧自由基的过度生成，降低血中CK、LDH、AST含量,从而改善骨骼肌细胞损伤，防止骨筋膜室综合征这一恶性循环进行性加重[15]。本课题组从2009年开始观察桃红四物汤治疗肢体缺血性疾病的疗效，疗效颇佳，并根据处方中各药物所含有效成分的理化性质，采用水提、减压及浓缩制成中成药桃红四物汤，便于保存，使用更为方便，在我院广泛运用，取得了很好的效果。前期动物实验显示其可以提高肢体缺血-再灌注损伤大鼠血清SOD的浓度，降低MDA浓度，减少氧自由基产生，减轻过氧化反应从而减轻肢体缺血-再灌注损伤[16]。但目前桃红四物汤对LIRI骨骼肌保护作用的分子机制尚不明确。

随着医学研究的深入，近年来国内外学者对LIRI的病理机制研究及防治重心逐渐深入至分子机制水平和信号因子靶向调控方面[5]。Wnt信号通路是一条繁杂的信号网络，在机体生长、发育、代谢、免疫、应激等多种生理过程中发挥着重要作用，Wnt5a是Wnt家族中具有代表性的Wnt蛋白，主要来源于巨噬细胞的效应分子，通过自分泌和旁分泌发挥作用，近年来广泛受到关注，其既能作用于经典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非经典的Wnt/Ca2+通路。其中Wnt5a/Ca2+信号通路的异常参与了许多疾病如肿瘤、炎症、代谢性等疾病发生和发展[17]，Wnt5a可介导不同的受体参与调节不同的Wnt信号转导通路，并最终导致不同的结果，最常见的受体为卷曲蛋白（Frizzled受体，Fz）受体，当Wnt5a信号与胞膜上Fz受体结合时，将膜磷脂（PIP2）水解，生成第二信使IP3和二酰基甘油（DG），由此激活Wnt/Ca2+信号通路，一方面通过IP3-Ca2+信号通路促进Ca2+大量释放，DG-PKC通路抑制Ca2+吸收从而导致细胞内Ca2+浓度持续升高，形成恶性循环导致钙超载，最终诱导细胞凋亡[18]；另一方面通过Wnt5a/Fz5-IP3R-CaMKⅡ信号途径和Wt5a/Fz5-DG-PKC-MAPK途径，诱导分泌IL-6、IL-8、MIP-1β、TNF-α等炎症因子释放，其中TNF-α既能促进NF-κB表达，又依赖NF-κB反作用于巨噬细胞，促进细胞自分泌Wnt5a，由此Wnt5a/Ca2+通路与炎症信号途径组成了繁杂的网络系统，二者联系密切又交互影响，Wnt5a/Ca2+通路的失衡会导致炎症应答的紊乱，从而诱发一系列炎症反应[19]。

课题组前期实验结果显示，桃红四物汤适宜剂量[1.35、2.70 g/（kg·d）]对预处理大鼠LIRI骨骼肌具有保护作用，并且呈量效关系，而过高桃红四物汤剂量[5.4 g/（kg·d）]不仅未出现理想的量效关系，反而加重骨骼肌损伤[8]。因此本实验设计以1.35、2.70 g/（kg·d）剂量为桃红四物汤低、高剂量。本研究HE染色显示模型组可见肌纤维紊乱、肿胀，大部分肌纤维完整性、连续性遭到破坏，细胞核散在稀疏，肌纤维间明显炎性浸润，提示造模成功。研究显示阻滞剂组，桃红四物汤低、高剂量组大鼠腓肠肌中IL-1β、TNF-α含量明显低于模型组，说明阻滞剂、桃红四物汤预处理可抑制炎症反应从而达到减轻LIRI作用。RT-qPCR和IHC结果显示，与正常组比较，LIRI各组中Wnt5a蛋白及其mRNA表达均一致性上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鉴于Wnt5a在Wnt信号通路中信号分子属性[17]，以及Wnt5a与炎症信号在炎症性疾病中的交叉互动作用[19]，这提示Wnt5a可能是LIRI中的关键蛋白，LIRI中骨骼肌Wnt5a表达上调，可激活Wnt信号通路从而介导骨骼肌细胞凋亡和炎症反应。与模型组比较，阻滞剂组，桃红四物汤低、高剂量组中Wnt5a蛋白及其mRNA表达一致性下调，而桃红四物汤低、高剂量组，阻滞剂组中Wnt5a蛋白及其mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＜0.05），说明LIRI经桃红四物汤预处理后，Wnt5a的表达下调，起到类似Wnt5a阻滞剂效应，在一定程度上抑制因LIRI所激活的Wnt5a信号通路，通过抑制炎症反应、减少细胞凋亡从而达到减轻LIRI作用，这和本课题体外实验研究结果一致[9]。本研究表明，时间因素和组别因素对IL-1β、TNF-α以及Wnt5a mRNA表达的影响存在交互效应，提示在肢体缺血-再灌注损伤早期，骨骼肌损伤的病理变化进行性进展，早期及时应用有效药物浓度干预有利于减轻这一病理过程，这为LIRI骨骼肌细胞损伤的分子机制和桃红四物汤的防治作用提供了实验证据。

本研究中桃红四物汤低、高剂量组IL-1β、TNF-α炎症因子水平下降高于同一时间点阻滞剂组，差异有统计学意义（P＜0.05）。我们推测这可能与引起LIRI的复杂的分子病理机制有关，鉴于Wnt5a是众多Wnt家族中的一员，以及中药多环节、多途径、多靶点效应，桃红四物汤在抑制LIRI炎症反应方面可能存在多途径、多靶点效应，这值得我们进一步深入研究。