敷和汤对CUMS联合孤养致抑郁模型大鼠的行为学及血清单胺类神经递质的影响*

郑若韵，贺 娟，熊为锋，王 旭，韩 玲，郝 宇

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

五运六气理论是中医学“天人合一”整体观思想的集中体现。运气理论认为疾病的发生受到天地气化的影响，因此在诊治疾病时应充分考虑运气学特点。“三因司天方”是陈无择根据运气七篇大论中关于不同中运，不同司天在泉下的运气特点，创立的16首针对每年易发疾病的方剂，后世应用于临床，多有奇效，成为历代医家以运气指导临床用药的代表。但是，目前关于运气方的研究多为临床个案验案的报道[1-3]，动物实验研究尚不多见，导致运气方临床疗效的科学性难以证实，也限制了运气方的应用推广。

精神类疾病是发病率高、致残率高、预后差的一类疾病，其中抑郁症以其发病率高，对人生活、工作影响大，且存在部分严重抑郁患者自杀现象而备受关注[4-5]。探索其发病原因与治疗措施，降低抑郁症发病率，提高临床疗效，是医学研究的重要内容。《素问》运气七篇大论中记载了大量干支运气与精神类疾病发生的相关性论述，如《素问·气交变大论篇》曰：“岁木太过，风气流行，脾土受邪，民病……忽忽善怒，眩冒巅疾。……岁火太过，炎暑流行，肺金受邪。民病……谵妄狂越。”《素问·五常政大论篇》言：“卑监之纪，是谓减化，……其主飘怒振发；……太阳司天，寒气下临，心气上从，……喜悲数欠。”以上“善怒”“癫疾”“谵妄狂越”“飘怒振发”“喜悲数欠”等皆是精神疾病的症状表现。且有研究证实抑郁症患者存在明显的五运六气禀赋特征[6]，抑郁症发病具有明显的五运六气时间规律[7]。由此推测在运气理论指导下创立的运气方对于精神类疾病的治疗可能有独到的作用。而精神类疾病的动物模型中，也以抑郁症的动物模型较理想而常用[8]。

因此本研究以抑郁症为切入点，复制国际精神药理学界公认的慢性不可预见性温和刺激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型[9]，研究2019年（己亥年）运气方敷和汤对抑郁模型大鼠的药效作用，并与临床疗效确切的西药氟西汀和中药柴芩温胆汤进行对比[10-11]，以期为运气方的临床使用提供科学依据，挖掘运气理论对于临床诊疗的重要指导价值。

1 材 料

1.1 实验动物8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g，购于北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物合格证号：11401500044296，动物许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于北京中医药大学动物房（SPF级），实验动物使用许可证号：SYXK（京）2016-0038。12 h昼夜循环，室温恒定在22～24℃，相对湿度保持在55%～65%。本研究通过北京中医药大学动物伦理审查，审查编号：BUCM-4-2019030507-1046，动物的饲养和使用符合国际动物伦理法。

1.2 药物 中药饮片均购自北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，经北京中医药大学中药学院专家鉴定合格。敷和汤方剂组成：半夏15 g，五味子15 g，枳实15 g，茯苓30 g，干姜10 g，橘皮15 g，枣仁15 g，诃子10 g，炙甘草15 g。柴芩温胆汤方剂组成：柴胡12 g，黄芩12 g，清半夏9 g，竹茹10 g，茯苓15 g，枳实12 g，陈皮15 g，炙甘草9 g。盐酸氟西汀（Patheam France，礼来苏州制药有限公司分装，批号：H20170003，规格：20 mg/粒）。敷和汤和柴芩温胆汤复方按照传统中药煎煮方法水煎煮2次，每次30 min，合并煎液，水煎浓缩至200%（相当于生药2 g/mL），4℃冰箱冷藏备用。盐酸氟西汀胶囊临用时用去离子水配成质量浓度为0.3 mg/mL的药液。

1.3 试剂 单胺类神经递质标准品：去甲肾上腺素（NE）（Sigma-Aldrich公司，批号：088K1147）；肾上腺素（E）（Sigma-Aldrich公司，批号：108K0930）；多巴胺（DA）（Sigma-Aldrich公司，批号：062426ED）；3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）（Sigma-Aldrich公司，批号：1364209 22509196）；高香草酸（HVA）（Sigma-Aldrich公司，批号：107K5002）；5-羟色胺（5-HT）（Sigma-Aldrich公司，批号：028K5152）；5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（Sigma-Aldrich公司，批号：1413645 14608169）。内标：3，4-二羟苄胺（DHBA）（Sigma-Aldrich公司，批号：04429MO）。色谱级甲醇（Fisher，批号：186358）；L-半胱氨酸（Amresco公司，批号：20120928）；磷酸二氢钠（Merck公司，批号：C10095211）；辛烷磺酸钠（Alfa Aesar公司，批号：T23B035）；乙二胺四乙酸二钠（Alfa Aesar公司，批号：G05R019）；氯化钾（Alfa Aesar公司，批号：J23R026）；蔗糖（上海国药试剂，批号：20190310，500 g/瓶）。

1.4 主要仪器Agilent 1100LC型高效液相色谱仪（美国Agilent，包括G1379A型脱气机、G1311A型色谱泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱）；DECADEⅡSDC型电化学检测器[荷兰ANTEC公司，包括玻璃碳工作电极、Ag/AgCl参比电极、工作站（Clarity CHS）]；Biofuge Stratos高速冷冻离心机（德国HERAEUS）；VCX130型超声破碎仪（美国SONICS）。

1.5 分组与造模40只SD大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法随机分为空白组、模型组、氟西汀组、柴芩温胆汤组、敷和汤组，每组8只。空白组群养，8只/笼，自由摄食、饮水，不给予任何刺激，其余各组动物孤养，1只/笼，接受42 d造模刺激。采用CUMS联合孤养方法建立抑郁大鼠模型[9]。CUMS：根据实验室条件，选取以下7种温和刺激。冰水游泳（4℃，5min）；束缚（3 h）；禁水（24 h）；禁食（24 h）；夹尾（1 min）；昼夜颠倒（颠倒昼夜顺序，08:00:00—20:00:00模拟黑夜，20:00:00—08:00:00模拟白昼）；45°笼具倾斜（24 h）。为避免大鼠产生应激刺激的耐受性，造模期间，每天随机施加一种刺激，每种应激不在连续的2 d内重复出现，7 d为1个周期。

1.6 实验给药 每天每只大鼠灌胃给药量按照成人平均体质量60 kg换算成大鼠的等效药物剂量（给药量=成人剂量×6.17/60）。氟西汀组大鼠灌胃给予2.057 mg/kg氟西汀混悬液（去离子水溶解）；柴芩温胆汤组大鼠灌胃给予9.667 g/kg柴芩温胆汤；敷和汤组大鼠灌胃给予14.397 g/kg敷和汤，每7 d复测大鼠体质量1次，根据体质量变化更新灌胃剂量。氟西汀组、柴芩温胆汤组、敷和汤组大鼠于造模后30～60 min灌胃给药，空白组、模型组给予等量去离子水。每天固定时间灌胃，1次/d，连续给药42 d。

1.7 观测指标

1.7.1 大鼠一般情况 观察大鼠皮肤毛发的色泽、枯荣，活跃程度，饮食情况，大小便状态等。

1.7.2 糖水偏好实验 在实验开始前，训练所有大鼠使其适应含1%蔗糖饮水。在糖水适应结束后应激刺激开始之前，进行糖水偏好基础值的测试，每组选用最接近总糖水偏爱基础值平均值的6只大鼠进行实验，即筛除对糖水极端敏感或极端不敏感的个体，分别于实验开始前1天（0 d）、实验开始后第7天（7 d）、第14天（14 d）、第21天（21 d）、第28天（28 d）、第35天（35 d）、第42天（42 d）进行糖水偏好实验[12]，记录大鼠的糖水消耗、纯水消耗、总液体消耗，并计算糖水偏好指数。糖水偏好指数=[（糖水消耗/总液体消耗）]×100%，比较分析各组大鼠在不同时间点糖水偏好指数的组间差异。

1.7.3 血清单胺神经递质的测定 采用高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）测定大鼠血清单胺类神经递质NE、DA、5-HT的含量。在完成大鼠各项行为学检测后，禁食24 h，用10%的水合氯醛，按照3 mL/kg的剂量，麻醉大鼠后，腹主动脉取血于采血管内，静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取约1.5 mL上清液于进口2 mL尖头EP管中，置于-80℃冰箱保存待测。

样品前处理：每500 μL血清加入100 μL裂解液（1.3 mol/L高氯酸，0.04%L-胱氨酸，2.0 mmol/L EDTA-2Na），冰浴超声破碎10 s。4℃、15 000 r/min离心30 min，取上清液-80℃冻存以析出蛋白，检测前再以15 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸过滤器过滤，取20 μL检测。

色谱条件：Skyam C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：磷酸二氢钠100 mmol/L，辛烷磺酸钠0.74 mmol/L，乙二胺四乙酸钠0.027 mmol/L，氯化钾8 mmol/L，甲醇8%，pH值为3；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；测定电极电势：500 mV。检测前额叶皮质、海马、下丘脑单胺类神经递质，包括去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）及其代谢产物3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）。

1.8 统计学方法 实验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，符合正态分布和满足方差齐性，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；重复测量计量资料采用重复测量方差分析。不服从正态分布者用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。统计图采用GraphPad Prism 7.0软件进行绘制。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状况 在实验开始之前，各组大鼠生长状态优良，行动灵活，二便、摄食饮水均正常。造模与给药结束后，与空白组比较，模型组大鼠精神状态极差，活动量明显减少，胆小，易受惊吓，常拱背蜷缩，皮毛枯黄无光泽，伴随摄食减少，大便稀溏等现象；与模型组比较，氟西汀组、柴芩温胆汤组和敷和汤组大鼠外观表征好转明显，皮毛色泽明亮、细腻光滑，精神尚可，活动度明显增加，摄食、饮水情况良好；大、小便情况尚可，总体情况接近空白组大鼠。柴芩温胆汤组和敷和汤组大鼠活跃度提高较氟西汀组大鼠更为明显，且柴芩温胆汤组和敷和汤组大鼠组间差异不明显。

2.2 糖水偏好实验结果 实验前（0 d）各组大鼠的糖水偏好指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），5组大鼠糖水偏好指数整体比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在分组效应，造模及给药结束后（42 d），与空白组比较，模型组大鼠糖水偏好指数明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，氟西汀组、柴芩温胆汤组、敷和汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.01）。所有大鼠不同时间点糖水偏好指数比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在时间效应。分组因素和时间之间存在交互效应（P＜0.01），随治疗时间的延长，模型组大鼠糖水偏好指数总体呈下降趋势，各治疗组糖水偏好指数在21 d（敷和汤组在14 d）后均呈现明显上升趋势。（见表1、图1）

表1 各组大鼠糖水偏好指数比较（±s，%）

表1 各组大鼠糖水偏好指数比较（±s，%）

注：F时间主效应=7.599，P时间主效应=0.000；F分组主效应=8.655，P分组主效应=0.000；F交互效应=1.858，P交互效应=0.019；与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量(g/kg) 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d F P空白组 6 - 85.69±9.35 80.85±12.01 93.85±6.12 75.40±23.7 83.65±7.56 88.72±7.15 88.09±5.68 0.688 0.662模型组 6 - 83.67±12.74 75.82±15.29 63.66±17.16a 59.04±18.36 56.19±18.33b 69.37±11.33a 49.93±14.75b 7.108 0.000氟西汀组 6 2.057×10-3 81.49±15.79 89.80±10.05 68.75±22.41 54.59±19.05 74.76±13.65c 91.42±4.28d 85.03±3.59d 3.859 0.010柴芩温胆汤组6 9.667×10-3 76.90±9.39 81.36±13.40 77.49±23.39 56.51±15.06 75.67±10.93c 89.68±4.68c 85.89±5.57d 2.621 0.049敷和汤组 6 14.397×10-3 86.83±8.92 81.55±11.87 56.09±13.88b 68.3±19.74 76.77±14.05c 84.35±4.00 88.36±9.63d 3.743 0.012 F 0.695 0.945 4.007 1.239 3.510 10.227 21.304 P 0.602 0.454 0.012 0.320 0.021 0.000 0.000

图1 糖水偏好指数时间和分组交互效应轮廓图

2.3 各组大鼠血清单胺类神经递质及其代谢产物水平比较

2.3.1 各组大鼠血清NE及其代谢产物E含量比较 与空白组比较，模型组大鼠血清E含量明显降低（P＜0.05），NE含量有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；氟西汀组、柴芩温胆汤组和敷和汤组大鼠血清NE、E含量与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清NE及其代谢产物E含量比较（±s，ng/mL）

表2 各组大鼠血清NE及其代谢产物E含量比较（±s，ng/mL）

注：与空白组比较，aP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量(g/kg)NE E空白组 8 - 165.01±69.37 10.17±3.93模型组 8 - 178.79±65.35 6.24±2.01a氟西汀组 8 2.057×10-3 165.05±58.0 4.47±2.94柴芩温胆汤组 8 9.667×10-3 215.94±72.46 6.18±2.81敷和汤组 8 14.397×10-3 189.22±45.57 5.87±3.12

2.3.2 各组大鼠血清DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量比较 与空白组比较，模型组大鼠血清HVA含量明显降低（P＜0.05），DA含量有明显降低趋势，DOPAC含量有升高趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，柴芩温胆汤组大鼠血清HVA含量明显升高（P＜0.01），氟西汀组和敷和汤组大鼠DA、DOPAC、HVA与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清DA及其代谢产物含量比较（±s，ng/mL）

表3 各组大鼠血清DA及其代谢产物含量比较（±s，ng/mL）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

?组别 动物数（只）给药剂量(g/kg)DA DOPAC HVA空白组 8 - 2.23±1.95 3.33±1.70 79.3±19.02模型组 8 - 0.53±0.45 3.79±1.96 50.5±16.08a氟西汀组 8 2.057×10-3 0.66±0.61 3.64±1.42 50.43±15.7柴芩温胆汤组8 9.667×10-3 0.70±0.55 3.23±1.24 74.04±15.62b敷和汤组 8 14.397×10-3 0.51±0.40 4.33±1.80 53.86±12.71

2.3.3 各组大鼠5-HT及其代谢产物5-HIAA含量比较 与空白组比较，模型组大鼠血清5-HT含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，柴芩温胆汤组、敷和汤组大鼠血清5-HT含量明显升高（P＜0.01），柴芩温胆汤组大鼠血清5-HIAA含量明显升高（P＜0.01）。（见表4）

表4 各组大鼠血清5-HT及其代谢产物含量比较（±s，ng/mL）

表4 各组大鼠血清5-HT及其代谢产物含量比较（±s，ng/mL）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量(g/kg) 5-HT 5-HIAA空白组 8 - 1 652.47±523.73 13.59±5.4模型组 8 - 1 001.84±403.62a 13.56±5.62氟西汀组 8 2.057×10-3 1 455.21±192.95 12.19±4.68柴芩温胆汤组8 9.667×10-3 2 212.75±561.96b 20.07±3.62b敷和汤组 8 14.397×10-3 2 096.79±449.69b 17.20±2.09

3 讨 论

本研究基于中医运气理论，观察运气方敷和汤对抑郁模型大鼠行为学和血清单胺类神经递质及其代谢产物的影响。根据运气理论，敷和汤适用于己亥之岁，厥阴风木司天，少阳相火在泉时段，全年木火之气盛行[13]。方中半夏辛能润下，合茯苓淡渗，祛湿除黄；枣仁生用泻相火；甘草以缓厥阴，风在上，以酸甘泻之，火在下，以五味子之咸制之；干姜温右胁之冷；枳实以泄脾之湿；陈皮、诃子醒胃悦脾。本实验于2019年（己亥年）开展，符合运气理论所述敷和汤适用的运气特点。实验中同时设置阳性对照药氟西汀及抗抑郁常用经典方剂柴芩温胆汤作为对照，探究运气情况对各方发挥抗抑郁疗效的影响。

CUMS是目前较为公认的抑郁症动物模型，联合孤养建立的动物模型能够稳定地模拟人类抑郁症患者的核心症状，即快感缺失，且具有高度的有效性，基于此模型研究抑郁症的病因学和抗抑郁药的作用有重要的科学意义[14]。而快感缺失程度则常用经典行为学实验糖水实验进行评估[12]。本研究采用CUMS联合孤养方法复制抑郁大鼠模型，结果表明经过6周的CUMS干预，模型组动物的糖水偏好指数明显低于空白组（P＜0.01），快感缺乏，符合抑郁症核心症状的主要表现，表明造模成功。实验前（0 d），各组大鼠糖水偏好指数基线水平具有一致性，各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药结束后（42d），与模型组比较，氟西汀组、柴芩温胆汤组、敷和汤组大鼠糖水偏好指数明显升高（P＜0.01），说明3种药物干预均具有改善抑郁症状的作用。

NE、DA、5-HT等单胺类神经递质属于中枢神经递质，参与机体运动、睡眠、情感等活动的调节，对神经系统正常的生理功能的维持发挥重要作用[15-16]。单胺假说是比较公认的抑郁症的发病机制，大脑中5-HT及NE浓度水平或功能下降是导致抑郁症发生的生物学基础，DA亦参与了抑郁症的发病过程，因此提高单胺类神经功能，提升单胺类浓度，可以起到抗抑郁的治疗效果[17]。本研究中给药后，模型组大鼠血清E、HVA、5-HT含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。敷和汤则显著提高了血清5-HT含量（P＜0.01），柴芩温胆汤显著提高了血清HVA、5-HT和5-HIAA的含量（P＜0.01）。已有研究表明，重度抑郁症（MDD）患者的血清5-HT浓度明显低于健康对照组[18]；抑郁患者血浆DA代谢产物HVA和DOPAC水平明显降低[19]。本次实验中血清5-HT等单胺类神经递质水平的升高与抑郁行为改善的相关性也提示，血清5-HT及HVA可能在抑郁障碍的诊断和抗抑郁效果的判断中发挥重要作用。柴芩温胆汤作为抗抑郁常用经典方剂，已有实验研究表明其能有效改善抑郁症模型小鼠抑郁表现，增加模型小鼠脑组织中的5-HT含量[20]，本次实验结果与之相补充，为验证运气方的疗效提供有效对照。本次实验中模型组NE含量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究结果表明，敷和汤改善抑郁症状的作用较显著，其机制可能与上调大鼠血清5-HT含量有关。同时，一般情况观测中敷和汤组和柴芩温胆汤组的大鼠活跃度提高较氟西汀组大鼠更为明显，而两个中药组间未观察到明显差异；柴芩温胆汤组、敷和汤组大鼠糖水偏好指数均明显升高（P＜0.01），敷和汤组大鼠糖水偏好指数高于柴芩温胆汤组，但差异无统计学意义（P＞0.05），一定程度上说明改善抑郁症状的作用相当。我们据此推测实验中复制的抑郁症动物模型，其发病受到运气的影响，结合运气用药的治疗效果与常用经典方剂相当，提示了五运六气对于疾病发生的影响，说明根据运气特点指导临床用药有其现实意义。本研究仅对抑郁大鼠血清单胺神经递质的变化进行了分析，未对上游相关通路进行深入探究，是本研究的局限性。