益气滋阴汤治疗慢传输型便秘大鼠的实 验 研 究*

詹 敏，尹园缘，李 逵，宾东华，王珊苹

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是一种顽固性的慢性疾病，表现为排便次数减少、排便困难和便意减少或消失[1]。近年来慢传输型便秘呈高发趋势，我国的发病率为7.0%～20.3%[2]，其中老年人占了绝大多数。便秘通常分为原发性便秘和继发性便秘，慢传输型便秘属于原发性便秘[3]。虽然便秘症状尚不威胁生命，但它带来的疾病负担却不容忽视。长期便秘会加重原有的消化道症状，使消化功能进一步紊乱，用力排便甚至会诱发心脑血管疾病。便秘患者的反复就医和情绪低落，也会出现一些心理情绪障碍，对患者的生活质量、工作效率及医疗资源消耗都有一定的影响，给家庭和社会带来了沉重的负担[4]。中医药从整体观出发，在治疗慢传输型便秘方面有着非常理想的效果，但是具体治疗机制尚不明确，因此探讨STC的治疗机制对指导临床治疗具有重要的意义。本研究采用中西医不同的方法治疗慢传输型便秘模型大鼠，探究两者的疗效和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物20周龄健康的SD大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供），60只，体质量（180±15）g，动物许可证号：SCXK(湘)2013-0004，动物合格证号：43004700020983。本实验已通过本院实验动物伦理审查（ZYFY20160301-4）。

1.1.2 实验药物 益气滋阴汤药物组成：太子参30 g，白术30 g，肉苁蓉30 g，枳壳10 g，火麻仁20 g，制何首乌20 g，黄芪15 g，杏仁15 g，玄参15 g，槟榔10 g，甘草6 g（湖南中医药大学第一附属医院制剂室制备）；枸橼酸莫沙必利片（江苏豪森药业股份有限公司生产，批号：20160105）。

1.1.3 主要试剂与仪器 电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C），紫外可见分光光度计（上海spectrum公司，型号：SP-752），超微量分光光度计（美国Nanodrop，型号：One C），台式高速冷冻离心机（美国Thermo，型号：micro21R），实时定量PCR仪（美国Bio-Rad，型号：CTX96），RIPA蛋白裂解液（江苏碧云天，货号：P007B），Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天，货号：P0006），超敏化学放光显色试剂盒（江苏碧云天，货号：PA003 WB），Gold View核酸染料（北京索莱宝，货号28596580）。

1.2 方法

1.2.1 造模 参考文献[5]方法，用生大黄粉开水冲泡制成的混悬液灌胃，1次/d，首次给药剂量为150 mg/（kg·d），此后按150 mg/（kg·d）的剂量每日递增，至大鼠夜间12 h粪便含水比达70%以上时，维持剂量用药至大鼠夜间12 h粪便含水比降至50%以下，此为一个循环，再按150 mg/（kg·d）的剂量递增，如此进行3个循环，共计60 d，首次致泻剂量为1 950 mg/（kg·d），最终剂量为2 700 mg/（kg·d）。大鼠夜间12 h粪便含水比保持在50%以下为造模成功。

1.2.2 动物分组与给药方法60只SD大鼠随机取15只为空白组，其余45只造模成功后随机分为益气滋阴汤组、莫沙必利对照组、模型组，每组15只。

按照大鼠与人体表面积及体质量进行换算，益气滋阴汤组使用益气滋阴汤中药煎剂灌胃，2.5 mg（生药）/kg，1次/d，2周为1个疗程。莫沙必利对照组予莫沙必利片药液灌胃，1.5 mg/kg，1次/d，2周为1个疗程。模型组与对照组灌胃等量生理盐水，1次/d，2周为1个疗程。

1.3 观察指标

1.3.1 粪便数量及粪含水比 造模前后检测大鼠粪便数量及粪便含水比，粪便数量（粒）：将各组分为造模前、造模后及治疗后3个时期，每个时期均为14 d，收集每日粪便，计算总和。粪便含水比（%）为湿、干粪质量之差与湿粪质量的比值，湿粪质量为收集不同时期大鼠的湿粪进行称量，干粪质量为收集的湿粪置于恒温箱烘烤（90℃烘烤3 h）后称量。

1.3.2 大鼠结肠组织c-kit mRNA表达 实验结束后，各组大鼠禁食24 h，用乌拉坦浅麻醉后，打开腹腔，取距肛侧5 cm结肠全层，截取1 cm长，截取后3 s内放入液氮中以备实时定量荧光PCR检测使用。取各组大鼠结肠组织样本于匀浆器中，加入Trizol试剂提取总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度，并测定其浓度，根据逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录得到cDNA，进行PCR扩增。扩增条件：94℃，4min；94℃，40 s；60℃，30 s；循环40次。从NCBI中下载基因序列，采用Primer 5.0软件设计引物序列。相关引物序列：c-kit，F 5'-ATCATGGAG GATGACGATT-3'，R 5'-GCCATCCACTTCCAGGTAG-3'。采用2-ΔΔCt法计算结肠组织中c-kit mRNA表达水平。

1.3.3 大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达 取大鼠结肠组织，提取组织总蛋白质，应用BCA法测定蛋白含量，取50 μg总蛋白上样。进行SDS-PAGE电泳，转膜后，封闭处理1 h，加入一抗VIP、AQP3兔抗鼠多克隆抗体，孵育过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1 h，暗室加ECL化学发光剂压片，显影、定影后扫描X-胶片。

1.4 统计学方法 数据处理使用SPSS 24.0软件，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠粪便数量及粪便含水比比较 模型组、益气滋阴汤组和莫沙必利对照组大鼠造模后粪便数量和粪便含水比均较造模前明显降低（P＜0.05）；益气滋阴汤组和莫沙必利对照组大鼠治疗后粪便数量和粪便含水比明显高于造模后（P＜0.05），与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠造模后、治疗后粪便数量和粪便含水比均明显低于空白组（P＜0.05）。益气滋阴汤组和莫沙必利对照组大鼠治疗后粪便数量和粪便含水比均高于模型组（P＜0.05）。（见表1～2）

表1 各组大鼠不同时期的粪便数量比较（±s，粒）

表1 各组大鼠不同时期的粪便数量比较（±s，粒）

注：益气滋阴汤组为生药剂量；与空白组比较，aP＜0.05；与造模前比较，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.05；与造模后比较，dP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(mg/kg) 造模前 造模后 治疗后空白组 15 - 275.19±0.51 274.21±9.81 275.09±6.21模型组 15 - 272.42±5.37 175.13±3.17ab175.23±1.27a益气滋阴汤组 15 2.5 272.76±4.56 177.64±6.16b 270.77±5.32cd莫沙必利对照组15 1.5 271.82±5.68 174.93±4.77b 272.24±1.56d F 1.606 865.118 2 017.323 P 0.198 0.000 0.000

表2 各组大鼠不同时期的粪便含水比比较（±s，%）

表2 各组大鼠不同时期的粪便含水比比较（±s，%）

注：益气滋阴汤组为生药剂量；与空白组比较，aP＜0.05；与造模前比较，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(mg/kg) 造模前 造模后 治疗后空白组 15 - 74.3±6.1 66.1±4.2 65.1±5.5模型组 15 - 62.1±10.7 53.2±3.4ab 53.4±3.6a益气滋阴汤组 15 2.5 75.8±0.7 55.4±2.5b 68.1±3.5bc莫沙必利对照组 15 1.5 69.8±4.4 55.7±2.4b 66.4±4.8bc F 10.323 48.561 34.112 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平比较 模型组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达低于空白组（P＜0.01）；益气滋阴汤组和莫沙必利对照组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达高于模型组（P＜0.05）。（见表3、图1）

表3 各组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平比较（±s）

注：益气滋阴汤组为生药剂量；与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量(mg/kg)c-kit mRNA(RQ值)空白组 15 - 1.32±0.50模型组 15 - 0.05±0.01a益气滋阴汤组 15 2.5 0.25±0.14b莫沙必利对照组15 1.5 0.23±0.10b F 71.840 P 0.000

图1 c-kit mRNA表达扩增曲线与溶解曲线

2.3 各组大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达比较 模型组大鼠结肠组织中VIP、AQP3蛋白含量均高于空白组（P＜0.05）；益气滋阴汤组和莫沙必利对照组大鼠结肠组织中VIP、AQP3蛋白含量均低于模型组（P＜0.01）。（见图2、表4）

图2 各组大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达情况

表4 各组大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达比较（±s）

注：益气滋阴汤组为生药剂量；与空白组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.01

组别 动物数(只)给药剂量(mg/kg)VIP/βactin AQP3/βactin空白组 15 - 0.24±0.07 0.19±0.18模型组 15 - 0.58±0.09a 0.53±0.08a益气滋阴汤组 15 2.5 0.38±0.17b c 0.27±0.07b c莫沙必利对照组 15 1.5 0.39±0.08b c 0.28±0.08b c F 24.213 25.978 P 0.000 0.000

3 讨 论

慢传输型便秘目前已成为严重影响人类身心健康的重要疾病之一，其病理机制与Cajal间质细胞（ICC）功能、水通道蛋白表达、肠神经系统、肠神经递质、胃肠激素分泌等密切相关[6]，但具体发病机制尚未明确。临床上治疗方法众多，目前主要使用大黄蒽醌类泻剂治疗，如大黄、番泻叶、芦荟等。西医治疗慢传输型便秘多使用增加动力型药物（如莫沙必利）[7]、高渗性导泻药（如福松）、刺激性泄剂（如酚酞、脱氧胆酸）及微生态制剂等[8]。上述治疗近期有效，远期疗效不明显，容易形成大肠黑变病。长期使用会使肠道的敏感性降低，造成肠壁内神经元不可逆的损害[9]。

目前普遍认为，水通道蛋白3（AQP3）的异常表达能引起结肠对水分的过度吸收，从而导致肠道水液代谢紊乱，导致便秘的发生[10]。胃肠慢波始动细胞Cajal间质细胞的作用也受到重视，其细胞表达受酪氨酸激酶受体c-kit及其配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）调控，现有研究已证实SCF／c-kit信号途径在ICC前体分化、发育及存活中具有重要作用[11-12]。

中医学认为便秘病位在大肠，基本病机为大肠传导失司，与脾、肺、肝等脏腑的功能失调也有关，与自身气血、经络、五脏六腑也有一定关系[13-15]。既往一些医家常用大黄、芒硝、番泻叶等苦寒之品，易伤及脾胃，使“后天之本”失固，导致症状反复发作[16]。张西平[17]认为慢传输型便秘可以从“气虚”“阴虚”两方面论治。耿彬[18]、李超男等[19]研究表明治疗慢传输型便秘常用的健脾益气药有生白术、黄芪，常用的补阴药有沙参、麦冬。本次研究选择的益气滋阴汤化裁自《幼科直言》卷五中益气滋阴汤，前期的临床研究已经证实益气滋阴汤治疗老年慢传输型便秘具有显著的疗效[20]。益气滋阴汤中黄芪、太子参、白术，性甘温，可补肺脾之气，杏仁、火麻仁可润肠通便,玄参、制何首乌具有滋阴养血功效，槟榔、枳壳能够行气导滞，肉苁蓉则可补肾助阳，兼具润肠通便功效，甘草可调和诸药。诸药配伍共奏益气滋阴之功效，使得患者脾肺之气得生，补益精血，滋润大肠津亏，进而推动肠内糟粕下行，便结易解，缓解患者便秘。现代药理学研究显示：黄芪有增强细胞免疫、体液免疫的功能，白术可提高机体免疫力[21]，肉苁蓉具有抗衰老、缓解疲劳、润肠通便的功效[22]。

本次研究结果显示，模型组、益气滋阴汤组、莫沙必利对照组大鼠粪便数量、粪便含水比、结肠组织c-kit mRNA表达水平均低于空白组，结肠组织VIP、AQP3蛋白表达水平均高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；益气滋阴汤组、莫沙必利对照组大鼠粪便数量、粪便含水比、结肠组织c-kit mRNA表达水平均高于模型组，结肠组织VIP、AQP3蛋白表达水平均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。益气滋阴汤组大鼠粪便数量，粪便含水比，结肠组织VIP、AQP3蛋白水平及结肠组织c-kit mRNA表达与莫沙必利对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。此次实验研究证实益气滋阴汤能增加慢传输型便秘模型大鼠粪便量及粪便含水比，显著降低其结肠组织中VIP、AQP3蛋白的表达，提高大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平，其疗效与莫沙必利基本相当。

综上所述，益气滋阴汤可明显改善慢传输型便秘大鼠的肠道功能和粪便症状，作用机制可能与减少神经递质VIP蛋白和水通道蛋白AQP3的表达，以及增加SCF/c-kit信号通路的表达有关。此次实验为益气滋阴汤的临床使用提供了实验依据，有助于益气滋阴汤的临床推广，也为进一步探究此方的其他作用机制奠定了基础。