SRPX2 和淋巴结转移密度对乳腺癌的预后价值研究*

周 虹，钱金锋*，杨其昌，张晓娟，桑秋霞

（南通大学第二附属医院病理科，南通 226001）

2018 年全球癌症统计数据显示,女性新发乳腺癌209 万例,死亡63 万例,发病率位居全球第二,死亡率位居全球第五,乳腺癌占女性癌症的首位[1]。含sushi 重复蛋白X 连锁2（sushi repeat containing protein X-linked 2，SRPX2）基因是H.KUROSAWA 等[2]于1999 年首次在白血病细胞中发现的,对细胞黏附及血管生成有非常重要的作用[3]。研究[4]发现,SRPX2参与了肿瘤的发生、发展过程,与肿瘤的侵袭与迁移密切相关。但SRPX2 在乳腺癌组织中的表达及对预后的影响尚不清楚。本研究对SRPX2 的表达及淋巴结转移密度（lymph node metastasis density，ND）[5]与乳腺癌患者临床病理特征及预后之间的关系进行分析,旨在为SRPX2 作为乳腺癌治疗新靶点提供一定的研究依据,对乳腺癌患者预后价值提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2004 年1 月—2006 年12 月在南通大学第二附属医院经病理确诊的女性乳腺癌患者标本110 例,年龄32～84 岁,平均51 岁；按照WHO 世界卫生组织第五版乳腺癌分类标准[6]:浸润性导管癌100 例,其他特殊类型10 例；TNW 分期:Ⅰ～Ⅱ期68 例,Ⅲ～Ⅳ期42 例；发生腋窝淋巴结转移53 例,无淋巴结转移57 例；肿瘤最大直径:≤2 cm 45 例,＞2 cm 65 例。本研究经南通大学第二附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 组织芯片技术及免疫组织化学方法 选取乳腺癌组织HE 切片及对应的乳腺癌组织蜡块,用显微镜观察其HE 染色结果,定位肿瘤在HE 玻片上的位置。然后,在蜡块标本上找到相应位置加以标记,通过组织芯片制作机将具有代表性的组织制成芯片蜡块,连续切片,进行免疫组织化学染色。本研究采用EnVision 染色法[7],所用试剂SRPX2 为兔抗人单克隆抗体（Anti-SRPX2）,购自Sweden Atlas 公司,工作浓度为1∶20。

1.3 结果判断标准 根据细胞的染色强度和阳性细胞数的百分比进行半定量分析[7]。用已知阳性组织作为阳性对照。染色强度判读标准:3 分（强着色）、2分（中等度着色）、1 分（弱着色）、0 分（无着色）。阳性细胞数计数:3 分（阳性细胞数＞70%）、2 分（＞30%～70%）、1 分（＞1%～30%）、0 分（无细胞）。将两项计分累加,4～6 分为高表达组,0～3 分为低表达组。ND 为切除的阳性淋巴结数与切除的淋巴结总数之比,分为:0 组、≤40%组、＞40%组[8]。

1.4 随访方法 患者术后2 年内每3 个月随访1次,3～6 年每6 个月随访1 次,6 年以后每年随访1次。随访截止时间为2019 年12 月31 日。110 例乳腺癌患者中失访15 例,死于乳腺癌48 例,随访时间32～179 个月,中位随访时间（117±34.91）个月。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件进行数据分析,相关性采用Spearman 等级相关分析法,计数资料采用双侧χ2检验,生存曲线采用Kaplan-Meier 方法,比较运用Log-rank 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌中SRPX2 的表达及ND 免疫组织化学染色结果显示,SRPX2 阳性细胞着色主要定位于细胞质,高表达72 例,低表达38 例（图1）。本组患者切除淋巴结10～21 枚,平均（15±3.75）枚,其中阳性淋巴结1～20 枚,平均（6±6.01）枚。ND:0 组57 例,≤40%组29 例,＞40%组24 例。

图1 SRPX2 在乳腺癌组织中的表达

2.2 乳腺癌中SRPX2 及ND 与患者临床病理特征的关系 乳腺癌组织中SRPX2 高表达及ND＞40%与患者TNW 分期及HER-2 的阳性表达呈正相关（均P<0.05）,与其他临床病理特征均无关（均P＞0.05）,见表1。

表1 乳腺癌中SRPX2 的表达及ND 与患者临床病理特征的关系

2.3 乳腺癌中SRPX2 的表达与ND 的相关关系SRPX2 低表达组中淋巴结转移6 例（15.8%）,高表达组中淋巴结转移47 例（65.3%）。结果显示,SRPX2 表达愈强,ND 就愈高,SRPX2 的高表达与ND＞40%呈正相关（rs=0.494，P<0.001）,见表2。

表2 乳腺癌中SRPX2 的表达与ND 之间的关系

2.4 乳腺癌中SRPX2 的表达及ND 与预后的相关性 SRPX2 高表达患者病死率为65.6%（40/61）,低表达患者病死率为23.5%（8/34）,SRPX2 高表达组与低表达组患者生存率差异有统计学意义（χ2=15.439，P<0.001）。ND=0 组、ND≤40%组及ND＞40%组患者病死率分别为30.8%（16/52）、65.2%（15/23）及85.0%（17/20）。ND 不同组之间生存率差异有统计学意义（χ2=19.614，P<0.001）,见图2。

图2 SRPX2 的表达和ND 对乳腺癌患者的预后影响

3 讨 论

SRPX2 基因是E2A-HLF 融合基因的下游靶基因,由465 个氨基酸残基组成,包括1 个DUF4174结构域、3 个sushi 重复结构域和1 个hyaline 重复结构域。SRPX2 是一种硫酸软骨素蛋白聚糖,蛋白聚糖是细胞外基质（extracellular matrix，ECW）的主要组成部分,在维持组织稳态方面起着生理作用。在肿瘤微环境中,蛋白多糖的表达发生变化,从而影响肿瘤细胞信号通路,在肿瘤生长、迁移和血管再生方面发挥多种功能,促进肿瘤的发生[9]。SRPX2 是尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）配体中的一种,在心、肺、脑等组织中均有所表达[10],生长发育过程中,SRPX2 通过血管内皮细胞表面的uPAR 促进微血管的生成。研究[11]发现SRPX2 能够与金属蛋白酶ADAWTS4、uPAR 和半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B 结合,影响ECW 蛋白的水解。随着ECW 结构的改变,细胞的迁移与侵袭能力增强[12]。异常ECW 通过促进细胞迁移与侵袭影响肿瘤的进展,并促进肿瘤炎症反应和血管生成[13]。

SRPX2 在胃肠道肿瘤中过度表达,其与肿瘤细胞表面的uPAR 结合,肿瘤细胞的迁移与侵袭能力增强,并增加黏附激酶的磷酸化,增强肿瘤细胞的黏附和迁移能力[14]。在前列腺癌中,SRPX2 高表达与Gleason 评分、淋巴结转移和远处转移显著相关,且与低生存率密切相关[15]。在肝癌中抑制SRPX2 的表达后,肝癌细胞的侵袭与迁移能力下降[16]。提示在恶性肿瘤中,SRPX2 可能作为致癌基因发挥作用,促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究发现乳腺癌组织中SRPX2 的高表达TNW 分期有关,在Ⅲ～Ⅳ期中表达高于Ⅰ～Ⅱ期,与在肝癌组织[15]中的研究一致。另外,本研究发现SRPX2 的表达与HER-2 阳性表达呈正相关,并与乳腺癌ND 相关,在SRPX2 高表达组中ND 明显高于低表达组,而与其他临床病理因素无关,可见SRPX2 与乳腺癌异常增殖和浸润转移有关。Log-rank 检验表明SRPX2 高表达组患者生存率明显低于低表达组,与前列腺癌[15]的研究结果一致。由此可见,SRPX2 的过表达与乳腺癌患者的不良预后显著相关。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,复发和转移受多种因素共同影响,预后与各临床病理特征之间的关系在各项研究中也有所不同[17]。其中,评估原发性乳腺癌患者治疗和预后的重要因素之一即术后腋窝淋巴结情况[18],国际上主要依据AJCC/UICC[19]提出的阳性淋巴结转移数目的N 分期来评价乳腺癌的淋巴结情况,虽然简单、直观,但受淋巴结清除程度的影响。ND 是切除的阳性淋巴结数与切除的淋巴结总数之比,它已被认为是许多类型癌症的预后因素[20],能较好地评估乳腺癌患者的无瘤生存时间[21]。在阴茎癌[22]中,ND＞15%与无瘤生存率和总生存率降低有关,是患者预后的独立危险因素,优于阳性淋巴结数目的评估。在口腔鳞状细胞癌肺转移的研究[23]中,ND＞7%与低生存率有关；K.YAWASHITA 等[5]研究表明,ND 在同一分期胃癌中有较好的预后分层,ND＞40%被认为是不可治愈因子,因其在Ⅲ期和Ⅳ期胃癌中提示相同的预后。本研究结果显示,乳腺癌组织中ND 与TNW 分期及HER-2 的阳性表达呈正相关,与其他临床病理因素无关,并且随着ND 的增加,患者无瘤生存率降低,提示ND 可以作为患者预后不良的一个因素,对临床治疗和预后评估具有重要的影响。

综上所述,细胞外基质蛋白SRPX2 及ND 与乳腺癌的侵袭和预后密切相关,联合检测有助于判断乳腺癌细胞的生物学行为和患者的预后。