达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C2C12分化的作用及机制的研究*

何廉旗,任智超,徐 丹，张翠丽，宋占春△

(1.辽宁省抚顺市中心医院心血管内科 113006；2.辽宁省抚顺市中心医院科教部 113006；3.大连医科大学基础医学院，辽宁大连 116044)

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。而骨骼肌占人体重量的40%，是人体最大的代谢器官，因此，骨骼肌功能完整对维持机体代谢稳态至关重要[1]。骨骼肌的肌纤维表面的卫星细胞是一种干细胞，当骨骼肌受到损伤(包括运动导致的牵拉伤、物理创伤、化学损伤等)时，静止的卫星细胞被激活，进行增殖、分化、融合，最终生长为成熟肌纤维，完成对受损骨骼肌的修复[2]。有研究表明，糖尿病患者骨骼肌卫星细胞分化能力明显降低，导致骨骼肌再生能力下降[3-4]。

新型口服降糖药——达格列净(dapagliflozin,DAPA)通过抑制钠-葡萄糖共转运蛋白2活性，促进尿糖排泄，降低血糖水平[5]。有研究表明，DAPA对腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate-activated protein kinase,AMPK)具有激活作用[6-7]。而AMPK是骨骼肌细胞分化的重要的调控因子，可通过激活一系列下游分子促进骨骼肌细胞分化[8-9]。尽管如此，DAPA在骨骼肌细胞分化中的作用尚少见相关文献报道。本研究采用小鼠成肌细胞系C2C12细胞作为研究对象，拟明确DAPA在C2C12细胞分化中的作用，并初步阐明其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠成肌细胞系C2C12细胞购自美国ATCC公司，DAPA购自美国MCE公司，胎牛血清及马血清均购自美国Gibco公司，AMPK抑制剂Compound C(CC)、小鼠抗生肌素(myogenin)抗体(ab1835)及小鼠抗肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)抗体(ab51263)均购自美国Abcam公司，肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性测定试剂盒及小鼠抗β-tubulin(SAB4200732)抗体均购自美国Sigma公司，小鼠抗生肌决定因子1(myogenic determination factor 1，MyoD)抗体(sc_32758)购自美国Santa Cruz公司，兔抗AMPKα抗体(2532s)及兔抗p-AMPK抗体(2537s)均购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

将C2C12细胞接种于100 mm培养皿中，使用含10%胎牛血清杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培养基(生长培养基)，于37 ℃、含5%CO2培养箱中进行培养，待细胞密度达到80%～90%融合时按1∶3进行细胞传代。传代细胞仍按上述培养条件继续培养，以备后续实验使用。

1.2.2细胞分化体系的建立及形态学观察

在生长培养基中待C2C12细胞融合至80%左右时将培养基更换为含2%马血清的DMEM培养基(分化培养基)继续培养，每隔1 d换液1次，诱导分化7 d，使用相差显微镜观察分化后肌管形态并采集图像，计算细胞分化指数(融合2个或2个以上细胞核的细胞的百分比)。药物干预即在基础培养基基础上加入不同浓度DAPA(终浓度为0、5、10、50 μmol/L)及CC(终浓度为10 μmol/L)。

1.2.3CK活性测定

1.2.4Western blot检测蛋白表达水平

收集1.2.2项各组细胞，加入蛋白裂解液于冰上放置30 min，4 ℃、10 000 g离心10 min，上清液为细胞总蛋白。采用蛋白定量(BCA)法测定蛋白浓度。50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺电泳。湿转法转膜后于5%脱脂牛奶中封闭1 h。加入一抗(稀释比均为1∶1 000)，4 ℃封闭过夜。次日，二抗(稀释比均为1∶5 000)孵育45 min后进行电化学发光(ECL)显色。采用ImageJ 1.51软件对Western blot带进行灰度分析。

1.2.5实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)

收集1.2.2项各组细胞，使用北京普洛麦格公司RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并测定其浓度及纯度。使用日本TAKARA公司逆转录试剂盒获取细胞cDNA。从NCBI网站下载小鼠MyoD、Myogenin、MyHC及GAPDH基因DNA及mRNA序列。采用primer 3.0软件设计引物，MyoD-正向:CAAGACCACCAACGCTGATC,MyoD-反向:CAGACCTTCGATGTAGCGGA;Myogenin-正向:ATCTGCACTCCCTTACGTCC,Myogenin-反向:GACAGCCCCACTTAAAAGCC;MyHC-正向:AGCTTGAAAACGAGGTGGAA,MyHC-反向:CCTCCTCAGCCTGTCTCTTG;GAPDH-正向:AGTGTTTCCTCGTCCCGTAG,GAPDH-反向:GCCGTGAGTGGAGTCATACT。采用实时荧光定量法测定上述基因循环数(cycle threshold，Ct)值，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环。通过2-ΔΔCT计算mRNA相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 DAPA促进C2C12细胞分化

DAPA以浓度依赖方式促进C2C12细胞分化，同时，细胞CK活性增加，见图1。DAPA 50 μmol/L组C2C12细胞分化指数、CK活性与DAPA 10 μmol/L组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，故选用DAPA浓度为10 μmol/L进行后续实验。

2.2 DAPA在mRNA水平及蛋白水平上调C2C12细胞MyoD、Myogenin、MyHC的表达

DAPA上调C2C12细胞MyoD、Myogenin、MyHC的表达，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 DAPA通过上调AMPK磷酸化水平促进C2C12细胞分化。

与DAPA组细胞分化程度比较，DAPA+CC组分化明显减低，差异有统计学意义(P<0.01),见图3 A、B。与对照组比较，DAPA组AMPK磷酸化水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；DAPA+CC组AMPK磷酸化水平及MyHC表达水平均明显低于DAPA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3 C、D。

A：相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20 μm)；B：分化指数柱状图；C：CK活性测定；a：P<0.05，与DAPA 0 μmol/L组比较。

A：实时荧光定量PCR分析mRNA表达水平，以GAPDH为内参；B：Western blot分析蛋白表达水平；C：灰度分析柱状图；对照组：未给予DAPA分化7 d的C2C12细胞。

A：相差显微镜观察细胞形态(比例尺=20 μm)；B：分化指数柱状图；C：Western blot分析蛋白表达水平；D：灰度分析柱状图；对照组：未给予DAPA分化7 d的C2C12细胞。

3 讨 论

随着生活方式的改变，肥胖及其相关代谢综合征的发生日趋普遍。骨骼肌是全身最大的代谢器官，对维持机体代谢稳态发挥着重要作用。骨骼肌再生是保护骨骼肌结构及功能完整的关键。骨骼肌再生分为4个阶段，包括卫星细胞增殖、分化、融合及生长。有研究表明，肥胖导致骨骼肌细胞分化障碍[10]。而在诸多调控卫星细胞分化的转录因子及信号分子中生肌调控因子(包括生肌因子5、MyoD、Myogenin和生肌调节因子4)最为重要[11]。首先，生肌因子5在卫星细胞分化初始阶段表达持续增加，随之激活其他生肌调控因子。随着MyoD高表达，卫星细胞正式进入分化阶段。MyoD、Myogenin相互交叉激活，与启动子或增强子区域的E-box元件结合，诱导一系列生肌相关基因的表达。有研究发现，下调MyoD或Myogenin会直接抑制骨骼肌细胞分化[12]。因此，MyoD、Myogenin在调节骨骼肌细胞分化中至关重要。

新型口服降糖药DAPA因具有独立于降糖作用以外的诸多优势备受关注。有研究表明，DAPA具有明显抗炎作用，对诸多脏器具有保护作用，如心脏、肝脏、肾脏及脑[13-16]。本研究采用DAPA作用于C2C12细胞，诱导分化，通过相差显微镜观察发现，DAPA可促进C2C12细胞分化。同时，DAPA使C2C12细胞中生肌调控因子MyoD、Myogenin及卫星细胞分化标志物MyHC表达增加，肌管特异性标志物CK活性增加。

有研究表明，肥胖抑制AMPK磷酸化，导致骨骼肌再生障碍[17]。而AMPK磷酸化是骨骼肌细胞分化的重要调控因子[18-19]。有研究表明，DAPA在许多组织中可促进AMPK磷酸化[7,20-21]。本研究结果显示，DAPA作用于C2C12细胞后AMPK磷酸化明显增加。而在加入CC干预后通过相差显微镜观察发现，DAPA促进C2C12细胞分化的作用消失，MyHC表达明显减低，说明DAPA通过增加AMPK磷酸化促进C2C12细胞分化。

综上所述，DAPA在小鼠成肌细胞系C2C12细胞中促进AMPK磷酸化，进而促进C2C12细胞分化。尽管如此，但DAPA在小鼠骨骼肌再生中的作用仍需进一步探究。本研究证实了DAPA在骨骼肌损伤后再生中可能存在潜在的价值，为临床肌病的治疗提供了新的思路。