超声细胞粉碎法快速提取真菌中的麦角甾醇

霍理坚,冯祖睿,林雅铃

(华南农业大学材料与能源学院,广东 广州 510642)

麦角甾醇,别名麦角固醇,是真菌细胞膜的重要组成成分,因其结构稳定,专一性强,可以将其含量作为真菌生物量的指标[1]。抗真菌药通过与麦角甾醇生物合成途径中的各种酶作用,干扰或阻断麦角甾醇生物合成,破坏真菌细胞膜结构而达到抑菌、杀菌目的[2-3]。麦角甾醇也是一种重要的医药化工原料,可用于生产可的松、激素黄体酮等甾醇类药物。为提高麦角甾醇的产量,国内外学者广泛开展了微生物发酵合成麦角甾醇的研究[4]。因此,无论是在真菌病害防治领域,还是药物生产领域,找到一种从真菌中快速提取麦角甾醇并准确测定其含量的方法是十分必要的。

目前,麦角甾醇的提取方法有皂化回流法、超声辅助提取法、微波萃取法或超临界流体CO2萃取法等[4],其中以皂化回流法最常见。皂化回流法存在提取时间长、温度高、有机溶剂使用量大、安全系数小等缺点[5]。超声波是一种高频机械振荡波,其能量会引起萃取溶剂的空化,而空化作用能加速传热和传质速率,从而破坏细胞膜[6]。目前超声波法的常用设备是超声清洗机[7-9],其超声波能量分布不集中,细胞粉碎效率不高,若能提高超声粉碎效率则有望缩短提取时间,提高工作效率。

水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)引发的水稻纹枯病是全球范围内危害最为严重的水稻真菌病害之一[10]。金针菇(Flammulinavelutipes)是常见的食药两用菌类，其富含维生素、氨基酸、纤维素等成分,具有很高的营养价值和药用价值,在功能性食品、医药保健品开发上具有很大潜力[11]。本研究先以水稻纹枯病菌为对象,采用具有较大超声粉碎功率的超声细胞粉碎仪,以甲醇为溶剂,探索和改进超声细胞粉碎法提取麦角甾醇的条件,用HPLC法测定提取后麦角甾醇含量;然后将优化的超声细胞粉碎法用于金针菇麦角甾醇的提取,以期能找到一种可替代传统皂化回流法且简单可行的麦角甾醇提取与测定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)由华南农业大学植物保护学院植物病理系真菌研究室提供。金针菇(毛柄金线菌,Flammulinavelutipes)购自华南农业大学农贸市场。

1.2 试剂和仪器

麦角甾醇标准品(纯度98.0%)购自成都乐美天医药科技有限公司;甲醇(色谱纯)、氢氧化钾、维生素C、氯化钠、无水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、无水硫酸钠均为分析纯,购自上海麦克林生化科技有限公司。试剂配制:2 mol·L-1氢氧化钾-乙醇溶液(KOH-EtOH),取KOH 11.2 g,加入EtOH溶解成100 mL;0.1 mol·L-1维生素C溶液,取维生素C 0.176 g,加无水乙醇100 mL;饱和NaCl溶液,取NaCl 25 g,加水50 mL振摇溶解,静置后取上清液;麦角甾醇标准溶液,精确称取麦角甾醇标准品5 mg,加色谱甲醇稀释定容至50 mL,质量浓度为0.1 mg·mL-1。

仪器:高效液相色谱仪(Waters 600-2998);Hypersil ODS 250×4.6 mm 5 μm色谱柱;JY92-IIDN超声细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BSA124S万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.3 麦角甾醇含量的测定方法

参照李治建等[12]方法,采用HPLC法,以甲醇为流动相,流速为1 mL·min-1,检测波长为260 nm,进样量10 μL,室温测定。以0.1 mg·mL-1麦角甾醇标准溶液作对照,外标法计算供试液中麦角甾醇的含量。

1.4 皂化回流法提取R.solani中的麦角甾醇

参照Heleno等[13]方法,称取约0.2 g菌丝干粉,精密称量,加入2 mol·L-1KOH-EtOH溶液10 mL,0.1 mg·mL-1维生素C溶液2.5 mL,60 ℃下恒温皂化45 min。皂化液放冷至室温,加入5 mL NaCl饱和溶液,以10 mL石油醚萃取3次,收集有机相,加少量无水Na2SO4除水,40 ℃旋蒸至干,以甲醇溶解转移至10 mL容量瓶定容。

1.5 超声细胞粉碎法提取R.solani中的麦角甾醇

1.5.1 正交试验确定最佳提取条件在前期预试验中,发现菌丝(g)与溶剂(mL)的比例(简称为料液比)、菌丝干粉超声粉碎前浸泡在溶剂中的时间、超声粉碎的功率、超声粉碎的时间等对麦角甾醇的提取率有一定的影响,故初步确定4个变量,即:料液比(A)、超声粉碎前浸泡时间(B)、超声功率(C)和超声时间(D),其变量水平见表1,选用L16(45)正交试验评价上述4个变量对提取率的影响并获得最优提取条件。

表1 正交优化试验因素与水平表Table 1 Level and factors in the L16(45)orthogonal experiments

超声细胞粉碎法提取麦角甾醇的试验步骤:将R.solani菌丝冻干,研细成粉,待用。考虑到麦角甾醇易溶于甲醇,HPLC法测定也以甲醇作为流动相,故在超声提取时,采用色谱纯甲醇作为溶剂。根据设定的变量条件,分别精密称取干燥R.solani菌丝冻干粉,置于15 mL离心管,准确移取设定量的甲醇,浸泡规定时间,称量;在设定的功率条件下,冰浴中超声处理设定的时间,放置室温后再次称量,滴加甲醇补足减失的量;摇匀,取溶液适量以0.45 μm尼龙滤膜过滤,得到供试溶液,用HPLC测定麦角甾醇含量。每个试验条件重复3次,取平均值。

1.5.2 含量测定方法学考察最佳提取条件的加样回收试验:取约0.20 gR.solani菌丝干粉9份,精密称定,分为高、中、低3个浓度组,分别加入含标准品0.75、0.50、0.25 mg的甲醇溶液,按1.5.1节中确定的最佳提取条件下进行提取,根据测定结果计算加样回收率。

重复性试验:取约0.20 g的R.solani菌丝干粉5份,精密称定,以上述最佳提取条件平行操作得供试溶液,测定并计算提取率及相对标准偏差(RSD)。

1.6 提取金针菇中麦角甾醇的方法

超声细胞粉碎法:取约0.20 g金针菇冻干粉3份,精密称定,置于15 mL离心管,准确移取10 mL甲醇,充分混合后浸泡20 min,称量;超声细胞粉碎仪超声(250 W,冰浴)处理8 min,放置室温,再次称量,滴加甲醇补足减失的量,摇匀,以微孔滤膜过滤,测定含量。

超声辅助提取法:取约0.20 g金针菇冻干粉3份,精密称定,置于15 mL离心管,准确移取10 mL甲醇,摇匀,称量,超声清洗机超声(250 W,40 ℃水浴)处理40 min,放置室温,再次称量,滴加甲醇补足减失的量,摇匀,以微孔滤膜过滤,测定含量[7,14]。

皂化回流提取法:取约0.20 g金针菇冻干粉3份,精密称定,加入2 mol·L-1KOH-EtOH 10 mL,在85～90 ℃下皂化3 h[7]。冷却后转移至分液漏斗,加入10 mL石油醚萃取2次,收集上层石油醚[15],旋转蒸发至干,用甲醇溶解转移至10 mL容量瓶定容。溶液以微孔滤膜过滤,测定含量。

上述提取试验均重复3次,取平均值,计算其RSD值并进行方差分析。

1.7 数据分析

采用Excel 2010软件进行绘图和处理分析数据。

2 结果与分析

2.1 麦角甾醇HPLC检测方法的建立

在1.3节所述的HPLC色谱条件下,得到麦角甾醇标准溶液(0.1 mg·mL-1)和菌丝提取液中麦角甾醇的色谱图(图1)。由图1可以看出:麦角甾醇色谱峰的保留时间约为14.423 min,样品峰与其他物质峰完全分离,分离度大于1.5。

图1 菌丝提取液和麦角甾醇标准溶液的HLPC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mycelium extract solution and ergosterol standard solution

麦角甾醇在0.010～0.200 mg·mL-1线性关系良好,标准曲线的回归方程为:

Y=15 181X+31 335,R2=0.999 9。

在相同条件下,0.1 mg·mL-1标准品溶液连续进样3次,麦角甾醇峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.59%,说明本色谱条件满足检测要求。

2.2 皂化回流法提取R.solani中麦角甾醇

根据文献所述的皂化法,按1.4节所述条件从R.solani菌丝中提取麦角甾醇,并采用1.3节中所述的方法进行含量测定。3次重复测试结果显示:菌丝中麦角甾醇含量约为2.18 mg·g-1,RSD为2.28%。

2.3 超声细胞粉碎法提取R.solani中麦角甾醇的正交试验结果及其提取条件优化

由表2中极差(R)值可知:料液比(A)对麦角甾醇的提取率影响最大,其次为超声前浸泡时间(B)、超声时间(D),超声功率(C)的影响最小。由表3方差分析结果可知:料液比、超声前浸泡时间对麦角甾醇提取率的影响较显著,而超声功率与超声时间对麦角甾醇的提取率影响不显著。基于此,确定以超声细胞粉碎法提取水稻纹枯病菌中麦角甾醇的最佳条件为A3B2C2D2,即:料液比1/50,超声前浸泡20 min,超声功率200 W,超声时间4 min。

表2 正交优化试验结果分析表Table 2 Analysis of the results from orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

2.4 超声细胞粉碎法的准确度和精密度

由表4加样回收试验结果可知:在超声细胞粉碎法的最佳提取条件下,麦角甾醇的加样回收率为92.22%～101.13%,平均回收率为96.53%,RSD为2.68%。由表5重复性试验结果可见:在最佳提取条件下其麦角甾醇的平均含量为2.59 mg·g-1,RSD为0.88%。试验结果均符合相关规定要求,说明此提取方法准确度高,重复性好。

表4 超声细胞粉碎法加样回收试验结果Table 4 Test results of sample recovery rate of ultrasonic cell disruption method

表5 超声细胞粉碎法重复性试验结果Table 5 Reproducibility test results of ultrasonic cell disruption method

2.5 3种方法提取金针菇中麦角甾醇的比较结果

由表6可看出:3种提取方法中,以超声细胞粉碎法提取率最高,需时最少,且重现性良好。方差分析结果显示,超声细胞粉碎法提取麦角甾醇的提取率与皂化回流法和超声辅助法提取麦角甾醇的提取率差异极显著(P<0.01)。

表6 皂化回流法、超声辅助法及超声细胞粉碎法提取金针菇中麦角甾醇的比较及方差分析

3 结论与讨论

麦角甾醇存在于真菌的菌丝细胞中,对其进行有效提取的前提是麦角甾醇必须能从细胞中溶出。超声波的机械效应、空化效应、热效应等作用有利于细胞的粉碎,促使麦角甾醇从菌丝细胞中溶出并迅速分散在提取液中。故相对于皂化回流法,超声辅助提取和超声细胞粉碎提取法的提取量均有所增加。一般认为,超声前的浸泡有利于甲醇与菌丝的充分接触,有利于超声波能量的传导,提高菌丝细胞的粉碎率,正交试验结果亦证实了这一点。当超声的功率达到一定值(250 W)时,已经基本实现对菌丝细胞的有效粉碎,故进一步提高超声功率和超声时间,对麦角甾醇的提取影响不显著。本试验还发现,当料液比为1/20时,供试样品中可见有未完全粉碎的菌丝,说明减少料液比(即增加溶剂的用量)也有利于菌丝在超声条件下的充分粉碎,麦角甾醇更易溶出,提取更充分。

利用超声波提取,以往常用超声清洗机进行超声辅助提取,其操作是把菌丝、提取液混合至容器(如锥形瓶)中,浸入清洗槽水浴超声。超声波从清洗槽底部的振子发出,透过水浴(体积相对较大)和容器才到达提取液,在此过程中能量分散弱化,要使细胞粉碎率高需时较长。而超声细胞粉碎仪的工作原理是超声波通过浸入在样品溶液中的钛合金变幅杆对容器中的细胞、提取液直接产生作用,能量集中,细胞粉碎效率高。试验结果证实了这一点,超声细胞粉碎提取进一步缩短了提取时间,且麦角甾醇提取率也有提高。

借助超声波进行提取比传统的皂化回流法用时大幅减少,且操作简单,溶剂使用量少。相比于超声清洗机,由于超声细胞粉碎仪可提供能量更为集中的超声波,因此用超声细胞粉碎法可得到更高的提取率,且试验结果显示该方法的准确度及重复性均达到相关规定。综上所述,超声细胞粉碎法可作为真菌菌丝中麦角甾醇含量快速测试的参考方法。本研究仅选择了较有代表性的植物致病菌和食用菌各1种作为试验材料,将来要对多种真菌进行研究,进一步确定超声细胞粉碎法应用于真菌中提取麦角甾醇的可行性。