surfactin生物合成及应用的研究进展

陈晓宇,赵洪源,陆兆新

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏 南京 210095)

surfactin,即表面活性素,是一种通过非核糖体合成途径合成的环状肽和脂肪酸链构成的强有力的脂肽类生物表面活性剂。它具有高效的抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、支原体等活性,在生物、医药、农业生产、食品加工、化妆品研发和制药等方面应用前景广阔,具有替代化学合成表面活性剂和防腐剂的潜力,这与现代绿色可持续发展的理念相契合。近年来,surfactin相关的生物合成途径引起了人们的广泛关注,surfactin复杂的生物合成网络和调控机制的研究取得了一定进展。另外,为了提高surfactin的发酵产量,利用物理、化学、分子改造等手段开展了高产菌株的选育及优化发酵工艺条件等研究。但由于大多数野生型芽胞杆菌surfactin产量较低,成本高,限制了surfactin的大规模生产和工业应用。因此,本文主要针对surfactin的生物合成调控、分子改造及其在农业、畜牧、食品等方面的应用进行综述。

1 surfactin产生菌株

自Arima等[1]首次发现枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)能够产生脂肽surfactin以来,抗菌肽产生菌集中在枯草芽胞杆菌的不同菌株之间的观点便被普遍认可。近年来发现,除枯草芽胞杆菌外,能产生抗菌肽的还有其他芽胞杆菌菌株(表1),诸多芽胞杆菌中,有些菌株只产生surfactin[2],而有些菌株能同时产生surfactin、fengycin和iturins[3]或surfactin、 bacillomycin和plipastatin[4];即使同一菌株产生的surfactin也不是纯的单一化合物,其同系物的组成有所不同。表1总结了surfactin的产生菌株及其所产脂肽。

表1 产生脂肽的菌株Table 1 The strains of producing lipopeptides

2 surfactin合成的基因簇

surfactin属于环脂肽类化合物,主要产自枯草芽胞杆菌[10]。surfactin是通过非核糖体多肽合酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成的。编码surfactin合成的酶基因的开放阅读框包含srfAA(401×103)、srfAB(400×103)、srfAC(143×103)、srfAD(27×103),总长度达27 kb。srfAA负责Leu、Glu和Val,srfAB负责Asp、Val和Leu,srfAC负责Leu,srfAD在surfactin引发肽链的环化反应中起重要作用。每个模块通常含有如下的结构域:腺苷化结构域(adenylation domain,A domain)、硫醇化结构域(thiolated domain,T/PCP domain)和缩合结构域(condensation domain,C domain)。另外srfAA和srfAB在第3个模块含差向异构化结构域(epimerization domain,E domain),srfAC含硫酯化结构域(thioesterification domain,TE domain)(图1)。A domain识别第1个氨基或羟酸结构单元,将其激活为氨基酰基腺苷酸,并转移至 T/PCP domain结构域,通过硫酯键进行连接。后续的包含C domain结构域的延伸模块,负责将T/PCP domain结构域上的氨基酸/羟基以肽/酯键的形式结合至前一个T/PCP domain结构域[11]。除A、T和C结构域外,在surfactin合酶中,模块3和6中的2个差向异构化结构域负责与T结构域结合的L-Leu外消旋。L-氨基酸和D-氨基酸的组合使肽具有独特的构象,这种构象对于细胞靶标的特异性相互作用很重要[12]。最后,srfAC末端连接的Ⅱ型硫酯酶基因srfAD,即终止模块的硫酯酶结构域,负责surfactin的环化和释放[13]。为了具备催化酶活性,肽合酶的PCP结构域必须通过特定的磷酸泛肽亚基转移酶从脱辅基形式转化为全氢形式。此外,surfactin合酶复合物由诱导型操纵子srfA(25 kb)编码,在操纵子srfA下游约4 kb处的sfp基因编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTases),这是surfactin生物合成复合物的PCP结构域从无活性的载脂蛋白转变为有活性的完整形式所必需的基因[12],且sfp行使激活surfactin合成酶的功能。

图1 surfactin合成基因簇[10]Fig.1 The gene cluster of surfactin synthesis[10]a. 枯草芽胞杆菌的surfactin生物合成基因簇及surfactin合酶的7个模块;b. 7个模块的作用。A:腺苷化;C:缩合;PCP:肽基载体蛋白;E:游离异构域;TE:具有硫酯酶活性的终止结构域。a. The gene cluster of surfactin biosynthesis in B.subtilis and seven modules of surfactin synthase;b. The role of the seven modules. A:Adenylation;C:Condensation;PCP:Peptidyl carrier protein;E:Free isodomain;TE:Termination domain with thioesterase activity.

3 生物合成的调控系统

基于以往研究报道的surfactin生产过程,本文归纳和构建了枯草芽胞杆菌中的一种全面性的surfactin生物合成途径(图2)。根据其功能划分为6个部分,包括特定的糖酵解和三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、脂肪酸生物合成、氨基酸生物合成、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成、surfactin的模块化酶促合成以及surfactin的外排和抗性[14]。

图2 枯草芽胞杆菌中surfactin的合成调控网络[15-16]Fig.2 The synthetic regulatory network of surfactin in B.subtilis[15-16]

3.1 前体供应单元

上游前体供应单元分成4个部分,提供了用于细胞发育和surfactin合成的基本前体,包括氨基酸、碳骨架、NADPH和ATP等。

第1部分代表碳或糖源的利用以及糖酵解途径和TCA循环,为细胞代谢提供碳骨架和能量。Zhi等[14]报道了编码糖转运蛋白、通透酶和6-磷酸蔗糖水解酶的基因分别为sacP、murP和sacA,它们在高产surfactin的解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciensMT45)中高效表达。糖酵解途径中许多关键酶的基因受CcpA调控。此外,CcpA可直接或间接控制与TCA周期相关的柠檬酸合酶基因(citZ)的表达[17]。Zheng等[18]指出,CcpA影响戈登氏链球菌(Streptococcusgordonii)黏附素基因的表达、发育和生物被膜的形成,但尚未建立CcpA与surfactin生产之间的网络[19]。

尽管N末端连接的脂肪酸是surfactin的关键元素,但它们的生物合成途径却鲜见报道。高产surfactin的解淀粉芽胞杆菌中大多数涉及脂肪酸合成途径的基因被上调[15,20]。除了NRPS外,脂肪酸的生物合成尤其是支链脂肪酸对于surfactin的合成至关重要,它是由构建前体乙酰辅酶A引发的。此外,丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶(phdABCD)的催化转化为乙酰辅酶A(图2)。Hu等[20]研究表明,存在脂肪酸合成的正调节因子,包括乙酰辅酶A羧化酶(accABCD)、丙二酰辅酶A(fabD)和β-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶Ⅰ(FabH)。LDH和PTA分别促进丙酮酸的代谢形成乳酸和促进乙酰辅酶A的作用以形成乙酰磷酸盐和乙酸盐[15]。FabH催化丙二酰基-酰基载体蛋白(ACP)与乙酰基-CoA缩合形成β-酮基丁酰基-ACP,这是直链饱和脂肪酸生物合成的第一步。枯草芽胞杆菌的FabH可以通过缩合乙酰CoA、异丁酰CoA、异戊酰CoA或α-甲基丁酰CoA与丙二酰辅酶ACP一同激活直链和支链脂肪酸的合成。支链脂肪酸合成前体异丁酰基-CoA、异戊酰基-CoA和α-甲基丁酰基-CoA可以分别衍生自支链氨基酸L-val、L-leu 和L-isoleu[20]。大肠杆菌硫酯酶(TesA)[15]和脂肪酸β-羟基化细胞色素P450酶(YbdT)在脂肪酸合成中发挥积极作用。Kraas等[21]的研究证明,3-羟基长链脂肪酸的后续活化是通过激活枯草芽胞杆菌中酰基CoA连接酶LcfA和LcfB的活力而引起的,最终被CoA激活的长链脂肪酸被认为是枯草芽胞杆菌的底物,即surfactin合成的起始(图2)。该部分代表surfactin合成的第2部分。

氨基酸合成模块涉及surfactin的固有成分Glu、Asp、Val和Leu的生物合成,这是surfactin合成的第3部分。支链氨基酸(L-isoleu、L-val和L-leu)参与surfactin的生物合成过程分为3个阶段:支链氨基酸生物合成、支链脂肪酸和CoA活化的3-羟基脂肪酸前体生物合成以及NRPS催化的合成(图2)。苏氨酸可由丙酮酸经柠檬酸循环,在草酰乙酸的作用下合成天冬酰胺,后经一系列作用合成,参与后续支链氨基酸的合成。支链氨基酸L-isoleu以苏氨酸为起点,在ilvA(L-苏氨酸脱水酶)作用下合成2-酮丁酸酯,之后由ilvBN、ilvGM、ilvIH、ilvC、ilvD、ilvE酶系(乙酰羟酸合酶Ⅰ、乙酰羟酸合酶Ⅱ、乙酰羟酸合酶Ⅲ、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、支链氨基酸氨基转移酶)共同作用实现生物合成[20,22]。支链氨基酸L-val的生物合成由与L-isoleu相同的酶系统调控。LeuA(2-异丙基苹果酸合酶)、LeuB(3-异丙基苹果酸脱氢酶)、LeuC(3-异丙基苹果酸脱水酶亚基)、LeuD(3-异丙基苹果酸脱水酶亚基 Ⅱ)作用于2-酮丁酸酯生成L-leu 的阶段,参与支链氨基酸的合成[15,20]。3个支链氨基酸进一步作用,所得中间体(支链α-酮酸)通过支链α-酮酸脱氢酶复合物转化为相应的支链酰基-CoA前体:α-甲基丁酰基-CoA、异丁酰基-CoA和异戊酰基-CoA[23]。随后,这些支链酰基-CoA和丙二酰-ACP在FabH的作用下,通过缩合反应得到3-酮-4-甲基己酰基-ACP、3-酮-4-甲基戊酰基-ACP和3-酮-5-甲基己酰基-ACP[24],并参与随后的脂肪酸合成。NADPH产生的模块包含磷酸戊糖途径的一部分,主要产生用于细胞代谢的NADPH和戊糖,属于第4部分,文中对此不进行陈述。

3.2 转录驱动和调控单元

surfactin的模块化酶促合成,称为中间转录驱动单元,这属于surfactin合成的第5部分。surfactin的生物合成和调控是多基因参与的、与群体感应(quorum sensing,QS)相关的复杂过程。生产surfactin的菌芽胞杆菌的感受态形成、芽胞形成、细胞游动性以及生物被膜的形成均与其合成相关[25]。细胞密度的信号分子、芽胞杆菌信息素ComX,一定浓度下会与膜蛋白组氨酸激酶ComP结合,诱导其自磷酸化,进而将磷酸基团转移至调控蛋白ComA,使ComA被磷酸化,磷酸化的ComA结合在surfactin合酶基因srfA启动子的特定区域,激活RNA聚合酶引发srfA的转录[26]。对数生长后期的营养应激可以刺激全局调控系统ComP-ComA和Spo0A-AbrB,从而诱导srfA的表达[27],其中Spo0A蛋白被认为是芽胞形成初期一种重要的调控蛋白,且与细菌生长后期感受态的形成、抗菌物质的分泌有关。镶嵌在srfAB内部的ComS基因的转录表达,决定芽胞杆菌形成感受态的起始,也参与枯草芽胞杆菌的生长发育[27]。

除ComX外,由phr基因编码的感受态刺激因子(competent stimulus factor,CSF)也参与surfactin的合成[27]。有研究表明,在枯草芽胞杆菌中,phrC基因表达产物是最主要的胞外CSF,并列出了其所具有的功能:1)低浓度下,刺激由ComA转录蛋白激活的基因表达;2)高浓度下,发挥相反的作用;3)促进芽胞的形成。有报道指出CSF通过调节ComA胞内磷酸化水平,与SigA共同作用,促进srfA操纵子的转录[27]。phr基因的上游有对应的负责编码天冬氨酰基磷酸酶的Rap基因[28]。Pottathil等[29]研究指出,胞外的phr前体肽通过寡肽透性酶Opp跨膜进入胞内,并与Rap蛋白结合,发挥磷酸酶抑制作用,而phr前体跨膜输出胞外的方式目前尚未求证。Auchtung等[30]研究发现,phr肽与Rap蛋白结合后,ComA保持磷酸化的活跃状态,从而促进srfA基因的转录。Bongiorni等[31]对枯草芽胞杆菌胞内的Rap蛋白研究发现,phr短肽可以专一性抑制包括RapA、RapC、RapE、RapF、RapG、RapI、RapK在内的7种Rap蛋白。最近Hayashi等[32]研究又发现,调控因子RghR能通过抑制Rap蛋白活性,来抑制DegU与DNA结合,进而抑制srfA表达。

DegU是二组分调节系统DegS/DegU的伴侣,在对数生长期起着关键作用[14]。磷酸化的DegU可促进胞外蛋白酶的合成,抑制sigD的表达;非磷酸化的DegU,能激发ComK的表达,诱发感受态形成。有研究观察到DegU的突变引起枯草芽胞杆菌中srfA基因的表达下调,认为srfA表达可以被DegU-P激活,且DegU转录/表达的增加与surfactin的高产量相关[19]。

ComA和SigA直接与srfA启动子结合以引发转录,对surfactin生产具有促进作用[14]。作为枯草芽胞杆菌次生代谢的主要调控子AbrB通过直接或间接方式抑制surfactin合酶的表达,进而抑制surfactin的合成[27]。先前报道CodY通过直接结合srfA启动子,占据DNA与调控蛋白的结合位点,抑制srfA的表达[33]。全局调控因子CodY的缺失也可为surfactin的生物合成提供能量和前体[15]。另外,基因Spx通过竞争α-CTD49中的重叠位点阻断启动子区域中ComA和RNAP之间的相互作用来抑制srfA表达[14]。srfA的另一个抑制因子是PerR,它可抑制枯草芽胞杆菌中sfrA的表达[34],但机制尚不清楚。SinI可以促进细胞基质的产生,间接抑制srfA的表达,导致surfactin的合成受到抑制[15]。最近报道,在枯草芽胞杆菌中,srfA在磷酸盐限制条件下受到PhoP的正调控[14];但也有研究显示PhoP与srfA展现出相反的表达趋势[15]。邓旗[9]研究发现,基因rne5可以同时调控srfAA、srfAC、srfAD,该基因是1个位于核糖核酸酶E的5′UTR中的顺式元件,这为surfactin高效表达提供了新的思路,但该基因的作用方式、作用条件等仍未被解析。

另外通过结构预测或组学分析获得的AbrB、Spx、PerR、PhoP、SinI等潜在的srfA转录调控因子,其功能的真实性有待明晰。这表明目前srfA转录的关键调控因子以及surfactin高效合成的调控机制仍不够清晰[20],尚待进一步的完善和发展。

3.3 外排和抗性单元

第6部分包含surfactin抗性基因的表达。抗菌活性、自抗性对于surfactin的高生产率至关重要[22]。研究表明,SwrC和AcrB可能协同作用以有效外排胞内合成的surfactin[15],且对菌体自身的保护和耐药性很重要[14]。与达托霉素(surfactin的结构类似物)抗性相关基因的liaRSFGHI操纵子在解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciensMT45中高效表达,尤其是liaH和liaI;在发酵后期过表达liaRSFGHI操纵子可能有助于菌体对抗高浓度的surfactin[14]。Hamon等[35]研究发现,转录因子Spo0A、sigma-H和AbrB可调节枯草芽胞杆菌生物被膜的形成,Spo0A还与芽胞形成和抗菌肽产生有关。Chen等[36]研究发现,作为重要的胞外信号因子,surfactin在生物被膜的形成中发挥作用。细胞膜上的组氨酸激酶(KinC)能够感知膜上surfactin攻击引起的K+渗透,使Spo0A磷酸化,诱导胞外生物被膜基质合成进而引发一系列细胞生理生化活动。在环境胁迫下,菌体产生的surfactin既能启动生物被膜形成,又能终止surfactin继续合成,是生物体确保最大限度存活率的自我保护机制。另外,一般在对数生长后期,DNA结合蛋白SinR在细菌受到外界营养物质缺乏信号刺激时发挥作用。SinR对细菌生物被膜形成也很重要,且与eps以及yqxM操纵子的表达关系密切。另外Hamon等[37]研究发现,Rap-Phr可与调控蛋白(Spo0A、ComA、DegU)作用,参与芽胞和感受态的形成,而ComA-P胞内浓度受Rap和Phr影响。

4 新型的分子改造

根据目前已有的报道,大多数野生型surfactin生产菌的产量都较低(50～100 mg·L-1)[1],这也是 surfactin 规模化生产及应用的瓶颈。采用传统的诱变育种或发酵优化策略,很难在生产上取得重大突破,而建立经基因修饰的surfactin生产菌株具有重要意义。目前主要的难点在于编码surfactin合酶的srfA操纵子的大遗传序列(超过25 kb)和群体感应系统的复杂生物合成调控[14]。srfA的异源表达具有挑战性,目前提高surfactin产量的菌株修饰主要有以下3种策略:替换或改造srfA模块的天然启动子Psrf[38]、增强surfactin的分泌外排以及修饰srfA的转录调控基因(表2)。

表2 基因工程改造菌株的surfactin产量Table 2 The surfactin production of strains modified by genetic engineering

续表2 Table 2 continued

4.1 srfA模块的天然启动子改造

srfA模块遗传序列包含在26.2 kb的簇中,导致srfA异源表达不是提高效价的首选方法。而启动子工程被认为是提高surfactin生产力的最佳手段,可以满足规模化生产的要求[20]。生产surfactin的枯草芽胞杆菌,主要有组成型、诱导型和自诱导型3种启动子[47]。Wu等[15]利用强启动子P43,结合其他基因改造,显著提高了surfactin产量。Sun等[38]使用诱导型启动子Pspac代替天然PsrfA启动子的工程化枯草芽胞杆菌fmbR-1,将surfactin产量提高到3.87 g·L-1。Cheng等[48]研究发现,自诱导型启动子(Ppst和Pcry3Aa)对处于对数晚期和稳定期细胞的靶基因表达有效。除了使用天然强启动子外,Jiao等[40]整合了枯草芽胞杆菌的PgroE启动子区域、大肠杆菌lacI-lacO操纵子和枯草芽胞杆菌sigma因子的上游70、35和10区域的3个点突变,得到1个超强启动子Pg3,使surfactin产量达8.61 g·L-1,是原始菌株的15.6倍。启动子替换也有不利的结果,仍待进一步深入研究。

4.2 增强surfactin的分泌外排

surfactin跨膜外排的调节机制尚不十分清楚,但根据其具有增加生物膜的通透性、去稳定性的作用,推测跨膜运输可能是其分泌方式。Tsuge等[49]研究表明,可能存在转运蛋白介导的surfactin外排机制,且发现枯草芽胞杆菌宿主的表面活性和耐药性可以通过Yerp的无效突变而极大降低,其中Yerp编码1个与RND(耐药性,结瘤和细胞分裂)家族排泄泵同源的蛋白。Li等[43]用脂质体和跨膜转运抑制剂证实枯草芽胞杆菌THY-7中surfactin的转运能量,主要依赖于质子动力,而不依赖于ATP水解,并确定了依赖于质子动力的脂肽转运蛋白YcxA,该转运蛋白编码基因的移码突变导致surfactin无法在菌体中转运。Wu 等[15]研究发现,过表达SwrC、AcrB和Lia蛋白显著提高了surfactin的产量,并提出SwrC和AcrB协同促进surfactin分泌,且Lia蛋白促进细胞存活,使细胞在高surfactin浓度下生长。以上结果与Zhi等[14]报道的surfactin高产菌株解淀粉芽胞杆菌MT45中相应蛋白的表达水平相一致。

4.3 修饰srfA的转录调控基因

srfA操纵子的表达还受转录调控因子的调节。依赖细胞密度的细菌群体感应系统,在srfA操纵子的调节中起重要作用。ComX和CSF介导枯草芽胞杆菌芽胞形成的群体感应[50]。基因簇srfA(srfAB)中包含感受态调控基因comS,使srfA基因的转录受到信息素ComX 和感受态刺激因子Phr的调控[51]。Jung等[44]研究指出,信号因子ComX和PhrC的过表达可增加surfactin产量。将全局调控因子CodY直接结合到srfA启动子区域可以抑制srfA转录,使surfactin产量下降[33]。删除基因epsA-O和tasA-sipW-yqxM,能够提高srfA的转录[52]。此外研究人员也相继报道了srfA转录相关的负调节因子PerR、SinI和PhoP[15,32]。曹国强[53]研究发现,敲除phr基因surfactin产量是原始菌株的2倍,而敲除comA基因产量减少;过表达comA基因产量是原始菌株的2倍,过表达comK产量没有提高。另外,有研究还提供了一种surfactin高产菌株的完整组学概况,为surfactin生产菌的基因组和转录组的比较提供便利,并指出srfA操纵子表达、前体重定向和抗性能力的差异对surfactin的生产率影响巨大[14],为后续研究提供了基础和方向。

4.4 其他改造菌株的手段

Wu等[15]研究表明,剔除eps基因操纵子和tasA-sipW-yqxM操纵子,可使生物被膜相关基因无法转录,导致能量和底物重新分配于surfactin的生产。脂肪酸是surfactin的关键成分之一。支链脂肪酸的合成始于FabH催化支链α-酮酰基CoA与丙二酸-ACP的反应,且芽胞杆菌中的FabH对支链α-酮酰基-CoA具有更好的选择性。研究表明过表达与P43启动子融合的FabH可以增强支链脂肪酸合成,过表达lipALM可以消除BKD与其他硫辛酸依赖性复合物之间的脂酰化竞争,进而加强硫辛酸的生物合成,消除细胞生长和surfactin产生的抑制作用[15]。

除了使用基因工程获得高产surfactin菌株外,一些修饰surfactin结构的策略也逐渐被开发,主要集中于肽环和疏水性脂肪酸链。通过定点诱变、取代、插入、缺失和模块重排的方式,可极大限度重组非核糖体肽合酶生物合成模板中的肽模块,产生新肽结构。脂酰基结构的修饰是改造surfactin的另一种手段。Dufour 等[54]将C14surfactin线性化合成,得到相比环状结构更低的、甚至没有溶血活性的surfactin。Coutte等[45]研究发现,敲除负责最终降解支链氨基酸的lpdV基因,线性C14surfactin的比例会显著增加。姜建[55]利用分子手段,获得了缺失1个氨基酸、抑菌活性高、溶血活性低的surfactin脂肽。

5 surfactin在农业生产及食品领域的应用

5.1 农业生产

脂肽的抗细菌或抗真菌活性增加了枯草芽胞杆菌在环境中的竞争力,枯草芽胞杆菌是目前公认安全的微生物,其次级代谢产物具有抑制植物致病菌的能力,可用于农业上的生物防治,且效果显著[56-57]。戴芳等[58]在稻草和麸皮的堆肥中添加surfactin,证实surfactin具有抑制植物致病菌的作用,且堆肥时间极大缩短。另外,surfactin在农药中还具有助溶剂的作用,在促进农药作用的同时,还可促进有机农药降解,减少对环境的损害[56]。

5.2 畜牧及水产业

肽类抗生素可强烈抑制革兰氏阳性菌生长,促进畜禽生长。肽类抗生素在消化道内发挥作用,几乎不被肠道吸收[59]。若人类或动物采食后一般不存在体内残留问题,肽类抗生素长期添加在饲料中,既能调节畜禽肠道菌群,又不易使细菌产生耐药性,是效果稳定、无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的环保型饲料添加剂。吴先华等[60]研究表明枯草芽胞杆菌fmbJ所产脂肽对肉鸡生长性能及免疫机能具有较好的调节和促进作用。杨丽莉等[61]研究表明,枯草芽胞杆菌fmbJ所产脂肽对嗜水气单胞菌(Aeromonashydivphila)有很强的抑制效果,使银鲫的免疫及抗氧化能力得到显著提升。另外,surfactin具有增强鱼体生长性能,降低饲料系数,改善血脂水平,降低全鱼和肝脏粗脂肪含量,增加肠道绒毛和皱襞的高度,维持和修复肠道屏障,提升肠道脂肪酶和蛋白酶活性及抗氧化等能力[62]。

5.3 食品领域

我国目前食品添加标准允许使用的天然防腐剂主要有乳链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)[3]。在食品工业中,抗菌脂肽因为其表面活性好、分子质量较小、热稳定性强等优势,可以用作乳化剂,来提高乳中各构相之间的表面张力,使之形成均匀稳定的分散体或乳化体,从而改善食品的组织结构、口感和外观,达到提高食品品质的目的[63]。章栋梁[64]将高纯度的surfactin应用于肉品的防腐保鲜,结果显示 surfactin 能明显抑制肉丸中乳酸菌和假单胞菌属的生长繁殖,效果优于Nisin;同时 surfactin可以减少肉丸储藏过程中脂肪氧化和pH值的上升,显示出较好的护色功效,减少储藏过程中因微生物作用而产生的恶臭味。胡仿香等[51]研究发现枯草芽胞杆菌LS-9所产的脂肽surfactin,对串珠镰刀菌及孢子的生长、伏马菌素B1的合成、禾谷镰刀菌菌体的生长和呕吐毒素的产生均表现出一定的抑制作用,并成功将该脂肽运用于玉米的储藏。梅雨薇等[65]指出surfactin可显著降低食物中的致病菌李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)在不锈钢和聚丙烯表面的黏附力。

产surfactin的芽胞杆菌属于益生菌,surfactin本身也展现出类似于益生菌方面的作用,包括调节肠道菌群结构、助消化生长、降血脂等特性,并且surfactin 还具有降低胆固醇、抗凝血和抗氧化作用[66]。surfactin降低胆固醇功能主要体现在抗菌脂肽可以抑制胆固醇酰基转移酶或低密度脂蛋白胆固醇与巨噬细胞的键合作用,使巨噬细胞内存留的脂蛋白含量下降,体内胆固醇水平降低[66]。从这个角度考虑,脂肽surfactin具有诸多的益生菌功能,鉴于其高的安全级别,似乎不失为一种良好的食品添加物、辅料亦或是开发功能食品如保健食品的优选原料(作为膳食补充,缓解肥胖、高脂引起的Ⅱ型糖尿病等),这些可能会成为脂肽研究的新方向。

6 总结与展望

由于诸多的生物和物理化学特性,surfactin在科学研究和工业应用中引起相当大的关注,但目前的发酵工艺成本高,不能满足工业应用的需求。解决这一瓶颈的策略主要从2个方面开展:1)针对发酵工艺,开展优化或开发生物合成高效工艺研究,包括优化培养基配方、发酵条件。另外寻找廉价的生物质作为原料,例如农业或工业废弃物。但是存在发酵产量低、产物提取困难的问题[67]。2)针对生产菌株,包括高产菌株的筛选和菌株的分子改造,从根本上解决产率低的问题,以及采用低价高效的分离纯化技术以辅助生产。

目前对于surfactin的抑菌机制、合成调控机制(前体供应,NRPS调控,外排和抗性),包括引发模块(C-AGlu-PCP)的底物特异性,均需要进一步探究。基于分子水平的修饰,目前仍存在许多阻碍,如修饰surfactin肽环的组合生物合成技术,在非核糖体合成酶模块之间的功能连接,修饰肽产物效果的不确定性以及低产率问题,没有直接调节surfactin脂肪酰基结构的有效手段等。增强脂肪酸前体的从头合成途径可能是提高具有特定脂肪酰基结构surfactin产量的有效策略,需要进一步研究。随着基因工程和合成生物学的发展完善,高产、高转化率和高生产率菌株的构建指日可待。

就抗菌脂肽surfactin的应用而言,目前的产量仍然无法满足产业化需求,但对于小批量、高价值产品的应用可行性极大,例如高端化妆品及制药行业。另外从surfactin的功能与应用来看,主要是基于其强有力的表面活性、抗菌、抗肿瘤、抗炎症等特性,而对于其抗氧化作用、溶纤和溶血栓作用、抗肥胖细胞、改善肠道健康等可以作为益生角度的功能,并没有得到足够关注。随着人民生活水平不断提高以及对绿色健康食品的迫切需求,surfactin作为保健食品辅料或作为食品添加剂,其添加标准、安全性问题等可能会成为新的研究方向。