基于磁性纳米探针的莠去津残留荧光检测方法

刘金彤,蒲虹辰,叶林瑶,莫艳阳,杨红

(南京农业大学理学院/江苏省农药学重点实验室,江苏 南京 210095)

农药对于防控病虫和杂草并提高农业生产力必不可少[1]。莠去津属内吸型选择性除草剂,由于其高效除草性能而在世界范围内被大量使用。然而伴随着莠去津的广泛施用,其在水资源、土壤以及农作物中蓄积与残留,为环境安全以及人体健康带来了潜在的威胁[2-3]。因此,有效检测并定量环境中残留的莠去津对环境及污染评估至关重要。近年来,相继发展并广泛应用的如高效液相色谱、气相色谱、质谱法等一系列农药残留分析方法,均具有较好的灵敏度和重现性,但大多耗时且样品制备过程较为复杂[4-6]。因此,发展新型快捷、灵敏、选择性好的农药残留分析方法尤为必要。随着纳米技术发展,荧光纳米传感探针因其分析快速、灵敏度高、选择性高等特点,作为农药检测的新手段进入了研究者的视野[7-8]。相比于非特异性探针及蛋白功能化探针,适配体荧光纳米探针利用适配体特异性识别的锁钥机制,显示出对靶标识别的专一性,为识别复杂环境中的特定目标物提供了可能[9-10]。

本研究构建了适配体功能化的磁性纳米荧光探针,并将其应用于莠去津的残留分析检测。莠去津适配体及荧光素标记的编码DNA可形成非完全互补DNA双链,将该复合物修饰于磁性纳米粒子后,由于荧光共振能量转移[11-12],荧光素的荧光被淬灭。当特异性识别莠去津时,DNA双链解旋,淬灭的荧光被重新“点亮”,基于此建立定量检测莠去津残留方法,利用适配体结合莠去津,借助磁性特征实现对莠去津的富集,为开发新型农药残留检测技术提供试验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器FluoroMax-4 荧光光谱仪(日本堀场公司),UV-3600紫外分光光度计(日本岛津公司),高速冷冻离心机(日本日立公司),PCR仪(美国伯乐公司),高分辨透射电子显微镜(日本电子公司),万分之一分析天平(梅特勒有限公司),VORTEX-5旋涡混合仪(海门其林贝尔有限公司)。

1.1.2 试剂莠去津由江苏省农业科学院提供。六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、六水合氯化亚铁(FeCl2·6H2O)、高锰酸钾(KMnO4)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自西格玛奥德里奇公司。油酸(分析纯)、氨水(28%)购自南京化学试剂有限公司。DNA序列购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA序列包括:氨基化适配体(APT):5′-NH2-TGTACCGTCTGAGCGATTCGTACGAACGGCTTTGTACTGTTTGCACTGGCGGAT-TTAGCCAGTCAGTGTTAAGGAGTGC-3′;荧光素FAM标记的封闭链(FAM-L):5′-TGCAAACAGTACAAAG-CCGTTCGTACGAATCGCTCAGACGG-FAM-3′。

1.2 试验方法

1.2.1 合成磁性Fe3O4纳米粒子将16.2 g FeCl3·6H2O溶解在285 mL去离子水中,搅拌并加热至70 ℃。另将8.8 g FeCl2·4H2O溶解于20 mL去离子水中形成溶液,加入FeCl3溶液中,同时快速加入36 mL氨水(28%)。反应1 min后,逐滴加入9.32 g油酸,并继续在70 ℃反应1 h。

1.2.2 合成羧基化磁性Fe3O4纳米粒子利用永磁体施加外磁场,收集黑棕色Fe3O4磁性纳米粒子,乙醇洗涤2次以去除余量油酸,再用超纯水洗涤直至pH值接近7。加入320 mL 10 mg·mL-1KMnO4溶液,在超声清洗仪中超声8 h。经永磁体进一步磁性分离后,用去离子水洗涤3次,通过表面羧基改性得到表面带有羧基修饰的磁性纳米粒子。

1.2.3 构建磁性纳米荧光探针如图1-A所示,将APT(100 μmol·L-1)和FAM-L(100 μmol·L-1)等量混合放入PCR仪中95 ℃退火5 min,随后以5 ℃·min-1的速度冷却至室温,从而获得DNA双链APT-L。将10 mg EDC和20 mg NHS加入9 mL羧基化磁性纳米粒子(1 mg·mL-1)中,并在室温下振荡40 min。随后将1 mL双链APT-L(50 μmol·L-1)加入该混合物中并在室温下孵育3 h。将产物离心洗涤2次,并重新分散于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中作磁性纳米探针。

图1 磁性纳米探针的制备(A)及其应用于莠去津的荧光传感分析(B)示意图Fig.1 Schematic illustration of construction of magnetic nanoprobe(A)and its application in the fluorescent sensing of atrazine(B)

1.2.4 莠去津传感分析传感原理如图1-B所示。分别将不同质量浓度(0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1)的莠去津与磁性纳米探针(20 μL)于PBS(20 mmol·L-1,pH7.4)中混合,并将混合液于37 ℃避光反应30 min。测定激发波长492 nm下样品的荧光发射光谱及其520 nm峰值处的荧光强度,绘制莠去津检测标准工作曲线。

1.2.5 选择性及离子干扰性验证为了验证所合成探针对莠去津的特异性,分别将含有特丁津、西玛津、扑灭津、扑草净、莠灭净(均为1 μg·mL-1)等农药与探针孵育,并测定其荧光强度;为了验证莠去津检测探针对各种阳离子的抗干扰性,将含Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+(均为1 μg·mL-1)的莠去津溶液(1 μg·mL-1)与纳米探针均匀混合,测定其荧光强度。

1.2.6 加标回收率测定取南京农业大学实验基地未使用莠去津的稻田水及黄棕壤稻田土作为试样,并添加莠去津标准溶液使水样的添加水平分别为0.01、0.5和5 mg·L-1,土样的添加水平为0.01、0.5和5 mg·kg-1。稻田水先后用滤纸和0.45 μm滤膜过滤,将过滤后的稻田添加水样与探针共孵育,采用1.2.3节建立的荧光分析方法检测。稻田土壤样品晾干后,去除石子、植物组织等杂质,过孔径150 μm筛网后称取上述土样 2 g,加入15 mL乙腈与水(体积比为2∶1),超声提取后,再以4 000 r·min-1离心8 min,收集上清液,旋转蒸发仪浓缩至近干。用水将烧瓶中残留物超声溶解,定容至1 mL,取样进行荧光检测,每个添加水平重复3次。

2 结果与分析

2.1 磁性纳米探针表征

由透射电子显微镜(TEM)图可见:所合成的羧基化磁性Fe3O4纳米粒子形状较均一,粒径7～10 nm(图2-A),粒径小表明其具有较大的比表面积,有利于后续适配体的连接。同时,在羧基化磁性Fe3O4纳米粒子的紫外吸收图谱中可见一主吸收峰位于440 nm附近(图2-B)[13]。相比于Fe3O4纳米粒子,羧基化磁性Fe3O4纳米粒子由于表面具有更多的负电性的-COOH,其Zeta电位由原来的33.7 mV降至-11.0 mV(图2-C),进一步证明了羧基化磁性Fe3O4纳米粒子合成成功。此外,羧基化磁性Fe3O4纳米粒子具有较宽的紫外吸收峰,可淬灭修饰其上DNA链的荧光,为探针的设计提供可能。相比于羧基化磁性Fe3O4纳米粒子,利用双链APT-L功能化后,获得的磁性纳米探针在UV-vis光谱中具有新的260 nm DNA的特征峰,证明该探针合成成功。根据已知浓度APT-L溶液的荧光校准曲线(图2-D),将合成过程中含有游离APT-L上清液的荧光强度转化为相应的APT-L浓度,用初始APT-L浓度减去剩余浓度获得磁性纳米探针APT-L的负载率为31.7%。如图2-B中插图所示,合成的Fe3O4纳米粒子溶液呈现均匀的黑褐色(左),而在右侧施加磁场后,该纳米粒子由于磁性作用引导被吸附贴于内壁(右),证明羧基化磁性Fe3O4纳米粒子具有在磁性作用下可分离的特性。

图2 羧基化磁性Fe3O4纳米粒子及磁性探针的表征Fig.2 Characterization of COOH-Fe3O4 nanoparticles and magnetic probeA. 羧基化磁性Fe3O4纳米粒子TEM图(插图:放大TEM图);B. 羧基化磁性Fe3O4纳米粒子及磁性探针的紫外-可见光谱图[插图:在无(左)、有(右)磁场作用下羧基化磁性Fe3O4纳米粒子溶液图片];C. Fe3O4纳米粒子与羧基化磁性Fe3O4纳米粒子的Zeta电位图;D. 不同浓度APT-L的荧光强度。A. TEM image of magnetic COOH-Fe3O4 nanoparticles(Inset:Enlarged TEM image);B. UV-visible spectrum of COOH-Fe3O4[Inset:Photograph of COOH-Fe3O4 magnetic nanoparticles suspended in water(left)and separated by an external magnet(right)];C. Zeta potentials of Fe3O4 nanoparticles and COOH-Fe3O4 nanoparticles;D. Fluorescence intensity vs. different concentrations of APT-L.

2.2 凝胶电泳试验

为了验证所合成的磁性荧光探针构建是否成功及其对莠去津的特异性响应,采用凝胶电泳分析,结果(图3)显示:相比于FAM-L(条带b)及APT(条带c)2条DNA单链,通过碱基互补配对而成的DNA双链APT-L,呈现出1条单一的条带(条带a);同时,由于其碱基分子更多,在凝胶电泳上受电场作用迁移距离更短,证明该APT-L双链DNA成功合成。

图3 APT-L(a)、FAM-L(b)、APT(c)、探针(d)及探针+莠去津(e)的凝胶电泳分析图Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis analysis image of APT-L(a),FAM-L(b),APT(c),magnetic probe(d)and magnetic probe+atrazine(e)

将APT-L双链通过共价键结合到羧基化磁性Fe3O4纳米粒子得到纳米探针后,探针由于纳米粒子的阻滞作用而停留于点样孔中,相应的APT-L双链条带消失(图3,条带d)。将探针与莠去津孵育后点样,则出现与FAM-L链(条带b)迁移距离类似的条带(条带e)。这可能是由于磁性探针内的莠去津适配体与莠去津之间具有强亲和力,二者特异性结合后可释放荧光标记的FAM-L链脱离探针,从而用于莠去津的识别与检测。

2.3 探针检测莠去津

将探针应用于莠去津传感分析试验中,在优化pH(pH7.4)条件下,磁性探针荧光对莠去津的响应在30 min孵育时间达到最佳(图4)。由磁性荧光探针的荧光光谱(图5-A)可见:在492 nm激发光下,探针的发射光谱峰值位于520 nm处,且其荧光强度较低,这是由于磁性荧光探针内载体对FAM-L链荧光具有较强的淬灭作用,为莠去津检测方法的建立提供了较低背景。将探针分别与0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的莠去津共孵育后,探针荧光峰位置未发生明显偏移,其荧光强度随莠去津质量浓度增加而逐渐增强,并在0.01～20 μg·mL-1与质量浓度(β)的对数呈良好的线性关系(图5-B)。线性回归方程:F=1 559 149 lgβ+3 611 861,R2=0. 998,传感器的最低检测限为8.17 μg·L-1。以上结果均表明开发的荧光探针可对莠去津残留实现传感分析,并具有较高灵敏度。

图4 不同孵育时间(A)和pH(B)条件下磁性探针对莠去津(1 μg·mL-1)响应的荧光强度Fig.4 Fluorescence intensity of magnetic probe in response to atrazine(1 μg·mL-1) at the incubation time(A)and pH(B)

图5 磁性探针测定莠去津Fig.5 Determination of atrazine by magnetic probeA. 磁性探针对0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1莠去津的荧光响应谱图(从下到上);B. 磁性探针荧光强度与莠去津浓度对数值的标准工作曲线。A. Fluorescence response of magnetic probe to atrazine at the concentrations of 0,0.01,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10 and 20 μg·mL-1(from bottom to top);B. The calibration curve of fluorescence intensity of magnetic probe vs. logarithmic value of atrazine concentration.

将本文构建的传感器和文献报道[14-19]的莠去津检测方法进行比较,结果(表1)显示:本试验制备的传感器的检测限比大多数已报道的传统方法低,而且具有较宽的线性范围,以上结果证明了DNA修饰荧光纳米探针的高负载效率及荧光方法的灵敏性。

表1 莠去津不同检测方法的比较Table 1 Comparison of various detection methods for atrazine

2.4 探针检测莠去津的选择性及抗离子干扰性验证

为验证检测体系测定实际样品中莠去津残留浓度的可行性与特异性,研究了此体系对一些常见农药的响应情况。由图6-A可见:相比于莠去津引发的强信号,探针对含有特丁津、西玛津、扑灭津、扑草净、莠灭净等农药几乎没有响应,说明修饰于探针的适配体对莠去津具有良好的特异性。为验证方法的抗离子干扰性,在检测莠去津体系中分别加入各种阳离子,并测定体系荧光强度。由图6-B可知:相比于仅加入莠去津(1 μg·mL-1)的对照组,共存离子Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+(均为1 μg·mL-1)对探针检测莠去津的干扰幅度均不超过对照组的4%。可见,纳米探针的荧光强度不受该浓度下阳离子的影响,具有一定抗离子干扰能力。

图6 常用农药(A)或共存离子(B)对磁性探针荧光强度的影响Fig.6 Effect of common pesticides(A)or coexisting ions(B)on the fluorescence intensity of magnetic probe in the presence

2.5 实际样品测定

为考察本方法的可行性,我们通过标准加入回收试验进行稻田水及稻田土实际样品中莠去津含量的测定。如表2所示:稻田水中添加0.01、0.5和5 mg·L-1莠去津时,其平均添加回收率为95.48%～102.03%,RSD为2.17%～3.14%;当稻田土中莠去津的添加水平为0.01、0.5和5 mg·kg-1时,其平均添加回收率为94.79%～100.66%,RSD为3.40%～4.72%。上述结果表明本检测方法均满足农药残留定量分析要求,检测限低于国家食品中农药最大残留限量标准(0.02 mg·kg-1)[20]。表明,基于磁性探针的莠去津残留检测方法具有较好的重现性及应用于实际样品检测的潜力。

表2 莠去津在不同样品中的添加回收率及相对标准偏差(n=3)Table 2 Recoveries and the relative standard deviations(RSD)of atrazine in real samples including paddy water and soil(n=3)

3 结论

本研究开发了基于磁性纳米材料的荧光探针,通过适配体修饰及DNA设计,将所开发探针应用于莠去津残留量的荧光传感分析。结果表明:所建立的莠去津残留荧光定量方法简单、高效,具有较高的灵敏度和较好的重现性,符合农药残留分析要求,并可应用于稻田水及稻田土中莠去津的定量检测。