米曲霉功能基因组-蛋白组学研究及其在发酵生产中的应用

钱晓庆，黄煌，陈茂彬，周冉冉，李可心，张玉*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 发酵工程教育部重点实验室，武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068；3.工业微生物湖北省重点实验室，武汉 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是一种好气性丝状真菌，归属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科、曲霉属。米曲霉是通过孢子繁殖，发芽后长出菌丝，其菌丝在生长初期呈白色，在生长后期呈黄绿色，老化后逐渐变为褐色[1-2]。分生孢子梗生长在足细胞上，分生孢子头一般呈放射状，少数为疏松柱形，顶囊呈球形或烧瓶形[3]。米曲霉菌落生长速度快、质地疏松，最适生长温度为30～35 ℃，产酶最适宜温度为28～30 ℃；相对湿度保持在95%左右比较合适；生长的最适pH是6.0左右，偏高或偏低，均不利于米曲霉的菌体中酶的分泌，同时也会影响酶的活力。

米曲霉作为一种丝状真菌在传统发酵食品生产中发挥着重要的作用[4]，是酒类酿造、酱类及酱油生产的核心菌株。米曲霉主要通过分泌蛋白酶[5-6]、淀粉酶[7]、糖化酶[8]、纤维素酶[9]等酶类对原料中的蛋白质、多糖、纤维素等大分子物质进行降解，从而提高发酵制品的风味。目前，工业用酶的50%由丝状真菌生产[10]，尤其是食品酶和饲料酶[11]。米曲霉易培养，不分泌黄曲霉毒素，1989年美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料公司协会认定米曲霉为安全微生物菌种(generally regarded as safe， GRAS)[12]。随着食品工业的发展，利用米曲霉等丝状真菌作为表达宿主生产蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等工业酶制剂的研究也愈发广泛。

我国人口众多，对发酵制品的需求量较大，因而成本和品质成为较为关注的问题，为获得性状优良的米曲霉菌株，更好地应用于传统酿造食品，菌种的选育和改良在现代发酵菌种技术中处于重要地位。目前我国传统酿造行业中一般是通过测定最终酶活力来反映发酵性能，从而选育优良的米曲霉菌株，人们对于米曲霉分泌的酶系以及相关基因的调控也有一定的研究，但系统性的深入研究并不多。本文通过综述米曲霉功能基因组学、蛋白组学以及在发酵领域中的应用研究进展，以期为后续米曲霉的研究提供指导。

1 米曲霉功能基因组学的研究进展

功能基因组学是利用基因组项目产生的大量数据来描述基因和蛋白质的功能和相互作用[13]。米曲霉在酿造工业中的重要应用以及高效的胞外蛋白分泌能力与其相关基因的调控是分不开的，研究表明米曲霉基因组中有135个胞外蛋白酶基因。全基因组序列的破译为米曲霉基因组改组技术提供了基础。Machida等成功破译了米曲霉RIB40的基因组，研究发现米曲霉基因大小为37.9 Mb，大约有3800万碱基对，8条染色体，长度分别为3.3，3.4，4.1，4.4，4.8，5.0，6.2，6.4 Mb，约1.2万个基因[14]。表达序列标签(EST)技术和DNA微矩阵技术的应用促进了米曲霉功能基因组学的发展。目前，大约有10个米曲霉菌株已被测序并存入公共NCBI数据库，这些菌株的基因组大小从35.42～41.16 Mb不等，在1.2万个左右基因中，只有约200个基因功能被鉴定。对米曲霉基因组基因进行GO功能聚类分析发现，在分子功能方面，水解酶活性、氧化还原酶活性和转运酶活性处在前列；在细胞组分方面，细胞核、膜和细胞质位于前三名；在生物过程方面，大量基因参与了糖类、蛋白质、脂类代谢以及分泌蛋白加工转运等过程[15]。米曲霉基因组中虽然大多数量基因是未知的，但是从基因组注释来看，米曲霉适合作为良好的宿主细胞用于工业化生产。根据基因组所包含的信息来控制米曲霉发酵，从而提高食品酿造业的生产效率和产品质量[16]。

米曲霉遗传转化系统的建立为进一步从基因水平深入研究和基因改良菌株提供了条件。Zhao等[17]通过比较米曲霉RIB40和米曲霉3.042基因组与转录组的数据差异，发现了2种米曲霉不同的分泌调控机制，在米曲霉3.042菌株中发现了更多的与细胞生长和环境抗性相关的基因，该菌株具有更强的生命力；而米曲霉RIB40特有的Na+、K+、甘油代谢相关基因较多，该菌株耐盐胁迫能力较强。在两个菌株中观察到许多编码酶的基因，这些酶对不同的醇、酸和氨基酸的产生有重要影响，在基因水平上分析了两种米曲霉用于发酵产品产生不同风味的原因。He等[18]通过对米曲霉不同生长阶段的转录组分析，揭示了不同类型基因在生长过程中的动态变化，利用RNA-seq分析了米曲霉的3个阶段，每个样本产生了2700多万个高质量读段。分析结果显示，从适应期向对数期和稳定期过渡时，差异基因表达较多，而从对数期向稳定期过渡时，差异基因表达相对稳定。对米曲霉基因组基因进行了GO功能聚类分析，对不同生长阶段的差异表达基因进行了分类，发现这些基因大多在单生物过程、代谢过程和催化活性方面得到了富集。从适应期向对数期转化时大多数基因表达增加，从对数期向静止期的稳定表达主要涉及碳水化合物和氨基酸的代谢，这对米曲霉在发酵领域的作用从基因层面进行了解释。

分析米曲霉分泌的各种酶的表达基因，将米曲霉进行遗传改造使其成为更加优良的菌种，已经成为米曲霉研究工作的重要内容。传统的米曲霉菌种改造有化学诱变、物理诱变、原生质体融合法等方法，通过采用常压室温等离子体诱变改良米曲霉菌株[19-20]，对比研究发现突变株产酶能力增强，酶活力均有所提高，氨基酸和还原糖的含量也显著提高，大大提升了酿造制品的品质。Cheevadhanarak等[21]应用寡核苷酸探针技术，从基因文库中获得了米曲霉碱性蛋白酶基因，并对该基因的序列进行了分析和测定，将该蛋白酶基因转化到米曲霉中，转化株分泌的蛋白酶量为初始菌株的6倍。

新兴发展的选择性标记基因应用技术、染色体大片段删除技术和DNA芯片技术等为米曲霉存在的mRNA的不稳定[22]、自身蛋白酶分解错误折叠的外源蛋白等不足提供了改善方法[23]，利用基因工程技术对菌株进行改造，如关键酶基因的超表达、代谢通路的激活、竞争通路的抑制，可显著提高米曲霉的生产能力。

通过基因组测序得到的编码蛋白大部分是功能未知的蛋白，功能基因组学与蛋白质组学联合应用，可以对米曲霉功能性蛋白进行更深层次的研究，为获得更多目的蛋白信息提供了研究思路和基础。

2 米曲霉蛋白组学的研究进展

米曲霉作为丝状真菌，其分泌物由高度动态的蛋白质组成，包括多种活性酶。蛋白组学是研究特定条件下蛋白质整体水平的存在状态及活动规律，主要包括蛋白质样品的制备、分离以及最终的鉴定。目前，米曲霉蛋白质组主要集中在相关功能性蛋白的表达情况上，双向电泳技术(two-dimentional electrophoresis，2-DE)及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的发展已经广泛应用于蛋白质组分的分析。

Hayakawa等[24]利用淀粉酶-绿色荧光融合蛋白(AmyB-EGFP)，荧光观察发现米曲霉胞外蛋白酶系参与分泌途径主要分布于菌丝顶端，通过顶端分泌的方式分泌至胞外[25]。且在米曲霉中，同源蛋白分泌量可超过10 g/L，而非真菌异源蛋白的表达量很低。Oda K等[26]运用双向凝胶电泳技术，利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术，通过肽质量指纹图谱比较了米曲霉RIB40在固体和液体培养条件下胞外蛋白的分泌情况，共鉴定出包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素降解酶在内的29种蛋白。刘晔等[27]以米曲霉ZJGS-LZ-12为研究对象，以米曲霉3.042为对照，运用双向电泳技术及生物质谱检测。研究发现米曲霉ZJGS-LZ-12与米曲霉3.042胞外分泌蛋白组存在显著差异，差异表达蛋白点共169个，主要是淀粉水解酶、纤维素酶、半纤维素酶及蛋白质酶，其中，淀粉水解酶、半纤维素酶活性显著增强，这些酶参与糖类和蛋白质水解过程，有利于豆制品的发酵生产。

在定性地明确米曲霉的分泌蛋白后，研究人员在已有的基础上进一步检测不同条件下米曲霉所产生的酶的酶学性质和活性，毛丙永等[28]从米曲霉3.042中分离纯化得到一种耐盐蛋白酶，并鉴定为钙蛋白酶RIM13，该蛋白酶在高盐度环境下仍具有较高的酶活力，在酱油的发酵生产中具有较大的应用潜力。Zhao等[29]采用2-DE技术比较米曲霉100-8(米曲霉3.042注入N+诱变而来)和米曲霉3.042的蛋白组学差异，鉴定出522个胞内蛋白，其中451个为差异蛋白点，在米曲霉100-8中，细胞内肽酶、糖酵解酶、tRNA合成酶、乙醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、硫胺生物合成酶等含量较高，它们参与糖酵解、氨基酸合成代谢、次级代谢过程，这些蛋白与酿造酱油的风味相关，有助于增强酱油的风味。国内酿造行业普遍使用的酱油菌种是米曲霉沪酿3.042，产生的蛋白酶以中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主，黑婷婷等[30]采用离子注入法诱变经选育得到的A100-8菌株，其纤维素酶、糖化酶、蛋白酶活力较原菌种均有提高，有利于后续食品发酵的运用。

目前对米曲霉蛋白质功能的研究较少，已知功能的蛋白，它们的功能大多数是利用同源基因功能类推的方法推测出来的，米曲霉分泌蛋白的编码基因部分见表1，从米曲霉分泌的蛋白质入手，有助于更深一步了解基因组并阐明基因的功能，从而更加清晰地了解米曲霉的特性。

表1 米曲霉部分胞内胞外蛋白的编码基因Table 1 Genes encoding of some intracellular and extracellular proteins in Aspergillus oryzae

3 米曲霉在发酵制品领域的应用

米曲霉是一种高产复合酶的菌株，分泌包括蛋白酶在内的多种酶类。按照米曲霉所分泌酶的酶活不同，将其在发酵领域的应用分为两类：一种是分泌高活性的糖化酶，另一种是分泌高活性的蛋白酶。

高活性糖化酶分解淀粉质原料的能力强，把含淀粉和糖质原料的物质进行发酵产生酒精，这种米曲霉一般用于酒类酿造[31-32]。赵中开等[33]通过优化纯种米曲霉酒曲的制备工艺，使得米曲酶糖化酶活力显著提高到1110.79 U/g，为米曲霉酒曲的规模化生产提供了理论依据。葛祎楠等[34]以板栗作为酿酒原料，通过对4种米曲霉酒曲的感官评价及酶活进行测定，发现米曲霉2011作为板栗清酒的糖化曲种，其α-淀粉酶活力为1306.63 U/g，糖化酶活力为324.56 U/g，酸性蛋白酶活力为1036.33 U/g，显著改善了清酒的风味和营养价值。

高活性的蛋白酶分解蛋白质的能力强，在酱类[35-37]及酱油[38-39]酿造中运用较多。黄艳等以米曲霉A019为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变选育得到突变株ZA131，该突变株生长较快，菌丝较长而孢子较少，产酶能力增强，尤其是蛋白酶提升了38.46%，谷氨酰胺酶提升了18.25%，谷氨酸生成率提升了11.18%，对酱油酿造风味的提升有显著贡献；丁昊等[40]从米曲霉HDF-7中分离纯化获得的蛋白酶对大豆蛋白进行水解，发现氨基酸含量提高了18.2%，将纯化的蛋白酶加入原料中代替制曲，大大缩短了制酱时间。

米曲霉广泛用于酒类、酱类及酱油的发酵生产，不仅直接关系到原料利用率的高低，还进一步影响到发酵速度的快慢、成品的品质及风味等。因此，通过对米曲霉的功能基因组和蛋白组综合比较分析研究，对米曲霉基因组-蛋白质组信息及功能有了更加清晰的认识，对传统发酵食品的滋味、风味、色泽的调控具有重要理论价值。

4 结论

米曲霉是我国传统食品酿造行业中的核心菌株，是豆豉、酱油、清酒、黄酒等食品的关键发酵菌种，米曲霉主要通过分泌蛋白酶、糖化酶、纤维素酶等酶类对原料中的蛋白质、多糖、纤维素等大分子物质进行降解，提高发酵制品的品质。米曲霉全基因组序列已经被破译，但仍有大多数基因功能尚不明确，因而运用基因组学遗传改造技术来改良米曲霉菌株存在诸多限制和障碍。蛋白质作为生命活动的承担者，其种类和表达量都是特定情况下基因选择性表达的结果，因此将功能基因组-蛋白质组学结合起来分析，能够更加准确地阐述米曲霉机体的内部调控和反应机理，将有助于我们更加深入理解米曲霉酶系表达和酶蛋白分泌的调控机制，为有针对性地选育高蛋白酶活和高糖化酶米曲霉菌株提供了理论基础，从而有效地提升发酵制品的质量并降低生产过程中的成本，为米曲霉在食品行业的深度开发利用提供一定的技术参考。