液液萃取-全碳同位素标记-液质联用法测定酱油中玉米赤霉烯酮

阳曦，刘玮，向世杰

(1.绵阳市食品药品检验所，四川 绵阳 621000；2.四川省农产品质量安全中心，成都 610000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰刀菌产生的一类真菌毒素，在谷类和豆类及其制品中广泛存在[1]。人或动物食用被玉米赤霉烯酮污染的食物后，会对健康造成一定危害，主要表现为生殖系统和免疫系统毒性[2-4]。世界卫生组织规定玉米赤霉烯酮的最大耐受量为0.5 μg/(kg·d)，我国GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[5]中规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值为60 μg/kg。酱油的主要原料为大豆、小麦，均为受玉米赤霉烯酮污染的高风险作物。酱油在生产工艺上虽然有灭菌环节，但多采用高温巴氏消毒法(85～90 ℃)进行，而玉米赤霉烯酮具有较强的耐热性，在110 ℃以下加热1 h以上才能完全被破坏。个别生产经营者对酿造用粮存侥幸心理，在原料上没有严格把关，导致酱油产品中玉米赤霉烯酮超标。因此，非常有必要对酱油中的玉米赤霉烯酮进行检测和控制。

文献报道的玉米赤霉烯酮的检测方法主要有酶联免疫法[6]、薄层色谱法[7]、高效液相色谱法[8-9]、气相色谱-串联质谱法[10]、高效液相色谱-串联质谱法等[11-12]。酶联免疫法虽然灵敏度高，能够达到1.0 μg/kg，但特异性差，阳性样品需要进一步确证。薄层色谱法灵敏度较低，一般为0.1 mg/kg以上，同样不能准确地定性。高效液相色谱法虽然具有较高的灵敏度(通常能达到1.0 μg/kg)，但样品需要进行柱后衍生，分析时间长。气相色谱-串联质谱法同样需要衍生化处理，且方法的稳定性差，应用并不广泛。目前采用最多的是高效液相色谱-串联质谱法，该方法选择性强、灵敏度高、定量准确，是近年来测定真菌毒素的首选方法。免疫亲和柱净化为液相色谱-质谱联用最常见的净化方法，但该方法存在成本较高、耗时长等缺点。本文采用液液萃取法对目标物进行提取净化，前处理步骤简单，经高效液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量，实现了酱油中玉米赤霉烯酮的快速准确测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米赤霉烯酮标准溶液：100.0 μg/mL(乙腈)，青岛Pribolab公司；13C18-Zearalenone标准溶液：25.0 μg/mL(乙腈)，青岛Pribolab公司；乙腈(色谱纯)：美国Thermo Fisher Scientific公司；甲醇、无水乙醇：分析纯，成都市科隆化学品有限公司；三氯甲烷(分析纯)：重庆川东化工有限公司。

样品：市售酱油共18批。

U3000-4000 Q TRAP高效液相色谱-串联质谱仪 美国AB SCIEX公司；ME204T/02电子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Zearalenone标准使用溶液的配制

精密吸取Zearalenone标准溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.00 μg/mL的标准使用溶液。

1.2.213C18-Zearalenone内标使用溶液的配制

精密吸取13C18-Zearalenone标准溶液1 mL置于5 mL容量瓶中，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为5.00 μg/mL的内标使用溶液。

1.2.3 样品前处理

样品经充分混匀后，称取试样5 g于50 mL离心管中，加入13C18-Zearalenone内标使用溶液40 μL，涡旋混合后静置30 min。精密加入20 mL乙腈，涡旋5 min后以6000 r/min离心5 min，吸取上清液5 mL于氮吹管中，加入1 mL水、5 mL三氯甲烷，涡旋30 s后静置分层，弃去上层溶液，下层溶液于50 ℃水浴中用氮气吹干，加入1 mL 50%乙腈复溶，涡旋混匀，经0.22 μm水系滤膜过滤后，待测定。

1.2.4 空白基质溶液的制备

称取空白基质样品5 g于50 mL离心管中加入13C18-Zearalenone内标使用溶液40 μL，然后按1.2.3操作。

1.2.5 基质标准系列工作液

取Zearalenone标准使用溶液适量，用空白基质溶液制成浓度为5.0，25.0，50.0，75.0，100.0 ng/mL的基质标准系列工作溶液，每个浓度溶液中内标物13C18-Zearalenone的浓度为50 ng/mL。

1.2.6 液相色谱条件

色谱柱：Thermo Acclaim C18(3.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：35 ℃；流动相A：乙腈，流动相B：水；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件Table 1 The gradient elution conditions of liquidchromatography

1.2.7 质谱条件

电喷雾电离源(electrospray ionization, ESI)负离子模式；多反应监测(MRM)；离子化电压：4500 V；离子源温度：500 ℃；喷雾器压力：55 psi；辅助加热器压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；其他参数见表2。

表2 质谱分析参数Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在ESI-模式下，通过外置针泵连续进样，将浓度为1 μg/mL的ZEN和13C18-ZEN混合标准溶液泵入质谱仪。根据化合物的相对分子质量及分子结构特征，首先确定母离子的质荷比(m/z)，再调整碰撞能量，分别选择两个响应值大的碎片离子为子离子，以丰度最大的子离子为定量离子，丰度次之的子离子为定性离子，再分别优化碰撞能量和去簇电压，得到MRM方法参数。

2.2 流动相的优化

本试验比较了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液、甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液作流动相的色谱行为。在动态调整流动相比例的梯度洗脱程序中，使目标化合物在各流动相体系中获得最佳保留。结果表明，目标化合物在乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液体系中响应强度约为乙腈-水、甲醇-水体系的50%。以甲醇-水为流动相时，虽然目标化合物灵敏度较高，但是不能获得较好峰形。以乙腈-水为流动相时，目标化合物的峰形最好且灵敏度高。因此，最终确定以乙腈-水为本试验的洗脱溶剂。ZEN定量离子的MRM图见图1。

图1 ZEN定量离子的MRM图Fig.1 MRM diagram of quantitative ions of ZEN

2.3 提取溶剂的选择

本试验考察了乙腈、甲醇、乙醇作为提取溶剂对检测结果的影响。样品在20 μg/kg的添加浓度下，分别使用乙腈、甲醇、乙醇作提取溶剂，经三氯甲烷净化后采用13C18-Zearalenone做内标进行定量。发现通过内标进行校正后，3组检测数据回收结果相当，均高于90%，但是用乙腈作提取溶剂内标物的绝对回收率为72%，甲醇为61%，乙醇为60%，试验结果见表3。从最后得到的待测溶液颜色来看，乙腈提取样品后待测液为澄清透明的微黄色，甲醇和乙醇提取样品后待测液为黄色，且乙醇提取样品后待测液颜色最深，说明乙腈起到了较好的去除色素的作用。综合考虑，最后选择乙腈作为提取溶剂。

表3 不同提取溶剂对内标物回收率的影响Table 3 Effect of different extraction solvents on the recovery rates of internal standard substances

现行国标和文献中常使用乙腈-水(9+1)[13-14]和乙腈-水(84+16)[15]作为提取溶剂。本试验首先用乙腈提取目标物，发现乙腈与酱油完全分层，当在乙腈中加入部分水时，乙腈水提取溶剂会与酱油部分互溶，从而无法确定样品的稀释体积。因此，本试验采用纯乙腈作为提取溶剂，涡旋5 min进行充分提取，取得了较好的效果。

2.4 净化方式的选择

常用的真菌毒素提取液净化方式为免疫亲和柱净化法[16-17]及固相萃取小柱净化法[18]。这两种方式的净化效果虽然较好，但存在操作步骤繁琐、消耗时间长、成本较高等问题，不利于大批量样品的处理。本试验采取液-液萃取的方法进行净化，在提取液中加入三氯甲烷对目标物进行萃取，利用分配系数差异将乙腈中的目标物进行转移，起到净化作用。试验比较了三氯甲烷为1，3，5，7 mL的净化效率，当采用外标法定量时，目标物的回收率分别为60%、66%、75%、75%。因此，选择三氯甲烷使用量为5 mL作为萃取用量。

2.5 基质效应及内标的选择

本试验通过比较溶剂匹配标准曲线和基质匹配标准曲线的斜率来判定基质效应[19]，按下式进行计算：

当ME<-20%时，表现为离子抑制；当-20%≤ME≤20%时，表现为弱基质效应；当ME>20%时，表现为离子增强。

结果表明，当采用外标法定量时，ME为-47%；当采用内标法定量时，ME为-27%，均表现为基质效应抑制。

在食品理化分析时，目标物在前处理过程中会有不同程度的损失，在样品中加入与目标物化学性质相近的同位素内标，有助于校正样品的前处理过程，同时也能校正仪器在进样时引起的误差。全13C同位素内标与目标物有相同的结构和化学性质，且色谱行为一致，基质效应相同，在提取时加入稳定同位素内标能够反映样品前处理的效率，校正进样体积误差，对质谱离子化效率进行补偿，因此本试验选择13C18-Zearalenone作内标，并采用基质匹配标准曲线进行定量。

2.6 线性关系、检出限、定量限

对空白基质系列标准溶液进样测定，绘制工作曲线，计算回归方程。以定量离子信噪比S/N=3时对应的浓度水平为检出限，以定量离子信噪比S/N=10时对应的浓度水平为定量限，结果见表4。结果表明，在所测线性范围内，ZEN具有良好的线性关系，检出限、定量限均优于国家标准。

表4 玉米赤霉烯酮标准品回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 4 The regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of ZEN

2.7 回收率及精密度

按试验方法进行了3个水平的加标回收试验，每个加标水平平行6次试验，添加水平及结果见表5。结果表明，方法回收率为92.7%～96.0%，相对标准偏差小于3.0%，该方法具有良好的准确度和精密度。

表5 回收试验结果(n=6)Table 5 The results of recovery test (n=6)

2.8 样品的测定

对市售18批酱油以及原料用8批小麦、8批大豆按选定方法进行测定，结果18批酱油均未检出ZEN，3批小麦检出ZEN(3.5～41.3 μg/kg)，4批大豆检出ZEN(8.2～22.8 μg/kg)，均未超过GB 2761-2017规定的谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值60 μg/kg，说明生产企业在原料把控和生产工艺上控制良好。

对5批空白基质样品添加标准溶液进行基质加标试验，模拟阳性酱油样本，加标水平为20 μg/kg，通过该方法进行测定，回收率分别为91.5%、98.7%、99.2%、90.6%和96.3%。

3 结论

本试验建立了酱油中玉米赤霉烯酮的高效液相色谱-串联质谱检测方法，样品经20 mL乙腈提取，5 mL三氯甲烷萃取净化，用乙腈-水作流动相进行梯度洗脱，在负离子模式下进行多反应监测扫描，内标法定量测定样品中玉米赤霉烯酮的含量，该方法玉米赤霉烯酮在5～100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，回收率在90%以上，检出限为0.1 μg/kg。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好，能有效地满足酱油中玉米赤霉烯酮的测定。