正交法优化超声波辅助枣皮红色素提取工艺研究

王钊，李长滨，李玉江，许俊亚，李青静，张本尚，邹建*

(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046；2.河南省科学院高新技术研究中心，郑州 450002)

长期以来，合成色素被大量用于食品生产，虽然合成色素廉价易得、性质稳定、色彩艳丽[1]，但其本身具有潜在的安全隐患，在人体内可代谢生成致癌物[2]，因此，对天然色素的开发成为人们关注的焦点。近年来，人们陆续研究开发了多种天然红色素，不但色彩鲜艳多样，还各自具有独特的生理功能，对合成色素形成了有效的补充。如甜椒红色素色泽光亮、色度稳定、视感良好，并可抗氧化、预防动脉粥样硬化[3]；山楂红色素具有防癌抗癌、保护大脑、保肝护肾等多重保健功效以及良好的抗氧化和着色能力[4]。

在众多天然红色素中，红枣色素引起了人们的广泛兴趣。红枣为鼠李科枣属植物的果实，与桃、李、栗、杏合称为我国古代的“五果”，是我国北方的重要果树之一[5]。红枣的营养成分丰富，不但被誉为“天然维生素丸”，还富含蛋白质、糖类、脂肪、有机酸、多种矿物质及胡萝卜素等营养成分[6-7]，以其药食同源的优点受到人们的喜爱[8-9]。其中，新郑红枣作为河南特色名枣，历史悠久、味道醇美，早已享誉中外[10]，除富含食品营养成分外，还含有多酚等多种功能成分[11]。但是，与现代食品工业相比，传统的餐饮加工模式对红枣资源的利用率却相对较低。例如，红枣皮中含有大量天然枣皮红色素，然而在许多食品的加工过程中往往将枣皮遗弃，对资源造成了极大的浪费。

研究表明，枣皮红色素色泽浓郁纯正，对光和热均较稳定，水溶性好，同时具有抗氧化、抗肿瘤、补血养气、止泻、抗菌、消除自由基等保健功能，可广泛用于食品、医药及化妆品着色[12]。当前对枣皮红色素的提取研究方法主要为溶剂浸提法，辅以超声波、微波、酶法等辅助提取手段，提取液多为不同浓度的NaOH水溶液[13]。鉴于此，本文拟对多种提取液进行筛选，特别是扩大NaOH之外的其他碱的种类，采用溶剂浸提法对枣皮红色素进行提取，并考察了超声波辅助提取法对枣皮红色素提取效果的影响，最后通过四因素三水平正交试验法在各单因素较优水平的基础上进一步优化提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新郑红枣：郑州市丹尼斯超市大学路店；氢氧化钠(分析纯)：天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钾(分析纯)、无水碳酸钠(分析纯)、无水乙酸钠(分析纯)、冰乙酸(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水碳酸钾(分析纯)：天津市盛奥化学试剂有限公司；无水甲醇(分析纯)：西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

RHP-500A型微型植物粉碎机 浙江永康市荣浩工贸有限公司；HWCL-3型集热式恒温磁力搅拌器、星火牌C型玻璃仪器气流烘干器 郑州长城科工贸有限公司；AE224型电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DSX-9243型电热鼓风干燥箱 河南捷隆科技有限公司；FreeZone型真空冷冻干燥仪 美国Labconco仪器公司；SB25-12DTD型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验步骤

1.3.1 红枣的预处理

参照张红等的处理方法，选择颗粒完整饱满的红枣，在沸水中煮5 min，然后立即放入冷水中，除去果肉，剥取枣皮，经挑选除杂后，清洗2～3次，将枣皮放入鼓风干燥箱中，于40 ℃条件下烘干至恒重，然后将干枣皮制成枣皮粉末(40目)，置于干燥器中备用。

1.3.2 筛选不同的提取溶液

分别称取7份干燥后的枣皮粉末(0.5 g/份)，将枣皮粉末置于100 mL圆底烧瓶内，分别加入NaOH溶液(0.2 mol/L)、KOH溶液(0.2 mol/L)、K2CO3溶液(0.2 mol/L)、Na2CO3溶液(0.2 mol/L)、乙酸钠溶液(0.2 mol/L)、甲醇和50%冰乙酸水溶液，设置提取温度60 ℃、提取时间3 h、料液比1∶20，在此条件下初步提取枣皮红色素[14]。停止反应，待反应液冷却至室温后过滤并浓缩，将浓缩液移至50 mL容量瓶中定容；然后，从中准确称取5 mL溶液，再次转移到50 mL容量瓶中定容。以相应提取溶剂为空白，通过紫外可见分光光度计进行全波段扫描，观察紫外吸收曲线，确定不同提取溶液中枣皮红色素的最大吸收波长位置。

1.3.3 单因素试验设计方案

分别考察溶液浓度(0.1～0.6 mol/L，每组间隔为0.1 mol/L)、料液比(1∶10～1∶35，每组间隔为1∶5)、提取温度(30～90 ℃，每组间隔为10 ℃)、超声时间(10～50 min，每组间隔为10 min)、提取时间(1～5 h，每组间隔为1 h)5个单因素条件。保持该5个单因素中的4个因素不变，依次考察溶液浓度、料液比、提取温度、提取时间、超声时间等因素变化对提取枣皮红色素的影响，通过优化各单因素条件，使5个单因素提取条件分别达到最优水平。

1.3.4 正交试验设计方案

在5个单因素试验条件优化的基础上对试验结果进行分析，并综合考虑各因素对枣皮红色素提取效果的影响。固定超声波辅助提取时间不变，选取溶液浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素中的较优水平，采用L9(34)正交试验水平表设计正交试验，进一步优化提取枣皮红色素的工艺条件。

1.3.5 对最优工艺条件的验证

在正交试验得出的最优提取工艺条件下重复提取枣皮红色素3次，以便验证正交试验结果，并对验证试验的结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同的提取液对枣皮红色素提取效果的影响

称取7份枣皮粉末(0.5 g/份)，将之溶于具有相同浓度的不同提取液中，通过紫外可见分光光度计在 300～740 nm波长范围内进行全波段扫描，测得每种提取液的最大吸收波长值，见表1。并在各自的最大吸收波长处测得相应吸光度值A，见图1。

表1 不同溶液的最大吸收波长Table 1 The maximum absorption wavelength of different solutions

由图1可知，在相同条件下，KOH溶液作为提取枣皮红色素的提取试剂时，吸光度值最大，提取效果最好，其次依次是NaOH、Na2CO3、K2CO3、乙酸钠、冰乙酸水溶液、甲醇。考虑到甲醇属于有毒试剂，因此不予考虑；KOH和NaOH的化学性质相似，综合考虑二者的安全性、经济性和提取效果，本文选取KOH溶液作为提取溶剂，并在此基础上进一步优化试验内容。

图1 不同溶液对提取效果的影响Fig.1 Effect of different solutions on the extraction effect

2.2 单因素条件对提取效果的影响

2.2.1 提取溶液浓度对枣皮红色素提取效果的影响

称取6份枣皮粉末(0.5 g/份)，分别按照浓度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mol/L准确配制相应的KOH溶液，以1∶20的料液比在60 ℃油浴中恒温提取3 h，过滤后定容至50 mL容量瓶中，从中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波长处平行测量3次，其平均吸光度值见图2。

图2 不同KOH溶液浓度对提取效果的影响Fig.2 Effect of different KOH solution content on the extraction effect

由图2可知，随着提取液中KOH浓度的增大，提取效率随之增大，当提取液浓度为0.5 mol/L时为最大值。此后，随着提取液浓度的增加，吸光度值反而减小，因此选取0.5 mol/L的KOH溶液为最佳提取液条件。

2.2.2 料液比对枣皮红色素提取效果的影响

称取6份枣皮粉末(0.5 g/份)，分别按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的比例准确量取0.5 mol/L的KOH溶液，在60 ℃油浴中恒温提取3 h，过滤后定容至50 mL容量瓶中，从中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波长处平行测量3次，结果见图3中a。

图3 不同料液比对提取效果的影响Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由图3中a可知，枣皮红色素的提取效率随着料液比的增大而增加，料液比1∶20时为最大值；当料液比大于1∶20后，枣皮红色素的提取效率随着料液比的增大而降低。为进一步确认最佳料液比条件，以料液比1∶20为中心，对其两侧的料液比进行精确筛选，结果见图3中b。当料液比从1∶18增至1∶22时，枣皮红色素的提取效率仍以料液比1∶20时最大，因此选择1∶20为最佳料液比条件。

2.2.3 提取温度对枣皮红色素提取效果的影响

称取7份枣皮粉末(0.5 g/份)，分别按照0.5 mol/L的KOH溶液和1∶20的料液比，在不同的油浴温度(30，40，50，60，70，80，90 ℃)下提取3 h，过滤后定容至50 mL容量瓶中，从中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波长处平行测定3次，结果见图4中a。

图4 不同提取温度对提取效果的影响Fig.4 Effect of different extraction temperatures on the extraction effect

由图4中a可知，枣皮红色素的提取效率随着温度的上升而增大，在30～80 ℃范围内，温度越高提取效果越好，80 ℃时效果最佳。当温度达到90 ℃时，提取效率有所下降，究其原因可能是当温度过高时枣皮红色素结构遭到破坏。以80 ℃为中心对其两侧的温度进行筛选，试验结果见图4中b。在70～90 ℃范围内进一步精确定位提取温度，可知当温度上升到85 ℃时提取效率最高，因此选择85 ℃为最佳提取温度条件。

2.2.4 提取时间对枣皮红色素提取效果的影响

称取5份枣皮粉末(0.5 g/份)，分别按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比、85 ℃的提取温度提取1～5 h，过滤后定容至50 mL容量瓶中，从中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波长处平行测量3次，结果见图5。

图5 不同提取时间对提取效果的影响Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction effect

由图5可知，在1～3 h内，提取效率随着提取时间的增加而提高，3 h时具有最大值；3～5 h之间，随着提取时间的延长，提取效率持续下降。因此，选择3 h为最佳提取时间条件。

2.2.5 超声时间对枣皮红色素提取效果的影响

称取5份枣皮粉末(0.5 g/份)，分别按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比，分别超声处理10～30 min后，在85 ℃油浴中恒温提取3 h，过滤后定容至50 mL容量瓶中，从中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波长处平行测量3次，结果见图6。

图6 不同超声时间对提取效果的影响Fig.6 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由图6可知，当超声时间增长时，枣皮红色素的提取效率也随之提高，在超声时间为20 min时，溶液的吸光度值最大，此后，随着超声时间的延长，吸光度值反而下降。超声时间为20 min时的提取效率远远高于其他超声时间，因此，选择20 min为最佳超声提取时间条件。

2.3 正交试验设计与优化

2.3.1 正交试验设计

由上述5个单因素试验结果可知，超声波辅助提取时间为20 min时提取效果最佳，且远高于其他时间，因此固定超声波时间条件不变，对KOH溶液浓度(0.4，0.5，0.6 mol/L)、料液比(1∶19、1∶20、1∶21)、提取温度(80，85，90 ℃)、提取时间(2，3，4 h)进行四因素三水平正交试验，从中筛选出枣皮红色素的最优提取方案。正交试验具体方案见表2，正交试验结果见表3。

表2 L9(34)正交试验因素水平设计表Table 2 The design of factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

表3 正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3中极差R值可知，虽然提取枣皮红色素的4个单因素条件均对提取效果有影响，但各影响因素的影响力却存在差异。已知各影响因素对枣皮红色素提取效果的影响力为：C(提取温度)>D(提取时间)>A(溶剂浓度)>B(料液比)，其中提取温度对试验结果的影响最显著。由正交试验结果可知，提取枣皮红色素的最优方案应为A3B2C1D3，即KOH溶液浓度0.6 mol/L、料液比1∶20、提取温度80 ℃、提取时间4 h。

2.3.2 最优工艺条件验证试验

为确保最优工艺条件的真实可靠性，通过3组重复平行试验对其进行验证，试验结果取平均值，见表4。

表4 重复试验结果Table 4 The results of repeated experiment

由表4可知，验证试验结果具有代表性，表明该提取工艺条件合理可行，具有良好的重现性。

3 结论

本文通过对提取液的筛选，首先确定了以KOH溶液为本试验的提取溶液，然后对提取枣皮红色素的各单因素条件进行优化。结果显示各单因素试验最佳条件分别为：提取液浓度0.5 mol/L的KOH溶液，料液比1∶20，提取温度85 ℃，提取时间3 h，超声时间20 min。通过对试验结果的分析，在正交试验设计中固定超声波提取时间20 min不变，则正交试验最佳提取工艺条件为：KOH溶液浓度0.6 mol/L，料液比1∶20，提取温度80 ℃，提取时间4 h。经过3次平行重复试验的验证，该最佳工艺条件下枣皮红色素吸光度值的重现性良好。

由试验结果可知，KOH溶液体系对枣皮红色素的提取效果明显优于当前提取枣皮红色素时普遍采用的NaOH溶液体系，表明本文对提取枣皮红色素的工艺条件优化结果的可行性和优势性，也为更深入地研究枣皮红色素的工业化生产提供了一定的理论支持。