响应面法优化超声波提取橘皮黄色素的工艺研究

李靓，朱涵彬，李长滨，潘春梅，岳晓禹，邓真真

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046)

近几年来，现代食品工业对色素的需求越来越大，人工合成色素具有着色力强、色泽亮丽等优点，但会导致过敏、腹泻、致癌等健康问题[1-2]，早已被大众弃用，天然色素的安全系数高，成为未来主流发展趋势已不可逆转[3-4]。柑橘在中国的种植范围较广、资源丰富[5]，常以鲜果果肉食用，橘皮大多被丢弃，忽略其二次利用价值。橘皮中含有丰富的天然色素、多酚类[6-7]、黄酮类[8-9]、果胶类[10]等生物活性因子，尤其是橘皮中的黄色素，作为天然色素的一种，作为食品添加剂使用量越来越多[11]。随着人们越来越注重食品的食用安全，渴望健康绿色的生活，又因橘皮黄色素良好的着色功能、独特的保健功能，如抗氧化[12]、防衰老、调节免疫力、减脂[13]、减少心血管疾病发生[14]等功效，在生物、医药[15]等其他领域的应用也较为广阔。

国内外对于黄色素的提取进行了较多研究，大多使用有机溶剂进行提取，操作过程复杂、费时费力、效率低[16]。超声波辅助提取法[17-18]简单快捷，提取率也比传统的提取法大大提高，在工业推广方面得到了广泛的应用。为了研究橘皮黄色素，高效的提取率显得尤为重要，本文拟利用超声波法辅助提取橘皮黄色素，通过响应面试验优化提高橘皮黄色素提取率，为橘皮黄色素的研究提供了有效的理论依据，为新功能产品的开发提供了技术指导。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

新鲜柑橘：购于郑州市永辉超市；无水乙醇(分析纯)：苏州辰泽化工有限公司；石油醚(分析纯)：南京化学工业园区；丙酮(分析纯)：天津富宇精细化工有限公司；乙酸乙酯(分析纯)：上海德榜化工有限公司。

1.2 仪器与设备

鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；高速粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司；电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；超声波清洗器 昆明市超声仪器有限公司；循环水式多用真空泵 上海予申仪器有限公司；紫外分光光度计 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘皮的预处理

将新鲜的橘皮梗去掉并清洗干净放在干燥的托盘上，在干燥箱温度达到60 ℃时放入橘皮开始干燥，6 h后取出在高速粉碎机中立即粉碎。压碎后的橘皮粉末通过40目筛后，放入真空袋中，置于阴凉干燥处备用。

1.3.2 黄色素提取溶剂的选择

称取橘皮粉末1.00 g于5个250 mL锥形瓶中，依次滴加蒸馏水、无水乙醇、石油醚、丙酮和乙酸乙酯各10 mL，在200 W的超声功率下处理15 min，抽取滤液1 mL定容于25 mL容量瓶中并作空白对照，在190～540 nm处进行紫外光光谱扫描，确定并分析每种溶剂下的最佳吸收波长，从而得到最合适的提取剂。

1.3.3 单因素试验条件设计

设置料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、超声时间(10，15，20，25，30 min)、超声温度(40，50，60，70，80 ℃)中3个因素固定的情况下，另1个因素的变化趋势对提取黄色素的影响，探究最优因素条件。

1.3.4 响应面优化试验设计

通过分析单因素试验数据，选取料液比(A)、乙醇体积分数(B)、超声时间(C)、和超声温度(D)4个因素为响应变量，以吸光度为响应值进行四因素三水平的响应面试验。响应面试验数据处理采用Design Expert 8.0.6软件，响应面试验设计因素水平表见表1。

表1 响应面试验因素水平及编码Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2 结果与分析

2.1 黄色素提取溶剂的选择结果

通过分析不同提取溶剂提取液的光谱扫描图见图1，得到黄色素的最大吸收波长在350 nm左右。丙酮、无水乙醇、蒸馏水和乙酸乙酯的提取效果都比较显著，但是蒸馏水中所含成分较多，不适用于工业生产中黄色素的分离与提纯，丙酮和石油醚属于极易挥发的化学试剂且石油醚遇明火时会发生爆炸，而乙酸乙酯的价格比较昂贵，并有刺激性气味，而无水乙醇具有价格低廉、方便回收等优点。综合对比分析，本试验选取无水乙醇为提取剂，通过选取该提取剂光谱扫描得到最大吸收波长348 nm，对该试验进行吸光度测定。

图1 不同提取溶剂的光谱扫描图Fig.1 Spectral scanning of different extraction solvents

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对黄色素提取液吸光值的影响

称取5份1.00 g橘皮粉末，按料液比(橘皮粉末和乙醇)为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25准确称量无水乙醇，在温度为40 ℃、超声功率为200 W的超声波仪中超声处理15 min，抽取1 mL滤液定容到25 mL的容量瓶中并作为空白对照，测定3次取其平均值，结果见图2。

图2 不同料液比对提取效果的影响Fig.2 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由图2可知，料液比在1∶10之前，随着料液比的增加，吸光度值也增加；当料液比达到1∶10时，黄色素的提取液吸光度值达到最大，效果最佳；此后继续增加料液比，吸光度值呈现下降的趋势。因此，最佳料液比为1∶10 (g/mL)。

2.2.2 乙醇体积分数对黄色素提取液吸光度的影响

称取5份1.00 g橘皮粉末，按乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%准确称量，在温度为40 ℃、超声功率为200 W的超声波仪中超声处理15 min，抽取1 mL滤液定容到25 mL的容量瓶中并作为空白对照，测定3次取其平均值，结果见图3。

图3 不同乙醇体积分数对提取效果的影响Fig.3 Effect of different ethanol volume fractions on the extraction effect

由图3可知，当乙醇体积分数小于70%时，吸光度值随着乙醇体积分数的增大而增加；当乙醇体积分数为70%时，橘皮黄色素提取液的吸光度最大；当乙醇体积分数大于70%时，吸光度值反而减少。因此，最佳乙醇体积分数为70%。

2.2.3 超声时间对黄色素提取液吸光度的影响

称取5份1.00 g橘皮粉末，按超声时间为10，15，20，25，30 min进行操作，在温度为40 ℃、超声功率为200 W的超声波仪中超声，抽取1 mL滤液定容到25 mL的容量瓶中并作为空白对照，测定3次取其平均值，结果见图4。

图4 不同超声时间对提取效果的影响Fig.4 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由图4可知，在超声时间小于15 min时，橘皮黄色素提取液的吸光度值最大。当超声时间在10～15 min内，吸光度值随着超声时间的延长也在逐渐增大，黄色素的浓度不断升高，但大于15 min，黄色素的吸光度值反而呈现逐渐下降的趋势。因此，可以判定超声时间15 min时提取效果最好。

2.2.4 超声温度对黄色素提取液吸光度的影响

称取5份1.00 g橘皮粉末，按超声温度为40，50，60，70，80 ℃进行操作，在超声功率为200 W的超声波仪中超声15 min，抽取1 mL滤液定容到25 mL的容量瓶中并作为空白对照，测定3次取其平均值，结果见图5。

由图5可知，提取液的吸光度值随着温度的升高而缓慢上升，当温度达到70 ℃时继续升高温度则吸光度值呈缓慢下降趋势，可能是温度过高导致了部分黄色素的分解，所以综合各方面来看，当提取温度为70 ℃时提取效果最好。

2.3 响应面优化结果分析

2.3.1 响应面优化设计和结果

通过对单因素试验结果进行分析，本试验选择料液比(A)、乙醇体积分数(B)、超声时间(C)和超声温度(D)作为响应因素，以提取液的吸光度作为响应值，进行橘皮黄色素提取的响应面优化试验。响应面分析设计及试验结果见表2。

表2 响应面分析设计与试验结果Table 2 Response surface analysis design and experimental results

2.3.2 响应面模型的方差分析

响应面二次回归方程方差分析的结果见表3，表3中料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度的P值均小于0.01，均达到极显著水平。应用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行多元回归拟合，得到4个变量的二次回归方程为：

Y=0.76-0.013A+0.017B+0.038C+0.031D-2.25×10-3AB-8.50×10-3AC+3.75×10-3AD-1.25×10-3BC+5.00×10-4BD+4.50×10-3CD-0.023A2-0.020B2-0.044C2-0.018D2。

式中：A代表料液比，B代表乙醇体积分数，C代表超声时间，D代表超声温度。

表3 二次回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression equation

续 表

该方程的相关系数为R2=0.9685，即拟合出来的理论值与96.85%的实际数据是相对应的。由表3可知，本试验失拟项并不显著(P值>F值=0.1909>0.05，说明该方程对试验拟合是合适的；且回归方差模型较为显著，P值>F值<0.0001。综合分析可以得出该响应面试验是有效可行的，且误差较小。接下来对软件处理出来的结果进行方差分析和显著性的检测。

2.3.3 提取工艺的响应面分析与优化

通过三维图能较为全面地凸显各影响因子间的交互作用并研究其相互影响力大小。其中三维图中呈现了各影响因子间在变化过程中响应值的变化状态，若图中曲面波动幅度较小则说明该因素对响应值的影响较小，反之若波动幅度大则影响较大。

图6 乙醇体积分数和料液比对吸光度的影响Fig.6 Effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on absorbance

由图6可知，当乙醇体积分数固定时，随着料液比的增加，吸光度值发生了先上升后下降的变化；当料液比固定时，随着乙醇体积分数的增加，吸光度值呈现变化缓慢的抛物线趋势。两者相比较，乙醇体积分数对吸光度值的影响大于料液比。在料液比1∶10时选择体积分数70%的乙醇得到最大响应值。

图7 超声时间和料液比对吸光度的影响Fig.7 Effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on absorbance

由图7可知，在乙醇体积分数为70%、超声温度为70 ℃时，超声时间对吸光度的影响比料液比更加明显，在料液比一定的情况下，随着超声时间的增加，黄色素提取液的吸光值也不断增加，但是当增加到一定程度时速度趋于平缓。

图8 超声温度和料液比对吸光度的影响Fig.8 Effect of ultrasonic temperature and solid-liquid ratio on absorbance

由图8可知，选择70%的乙醇超声15 min时，超声温度比料液比的变化曲度大，随着温度的升高，提取液的吸光度值也不断增大，但是当温度增加到一定值时，吸光度的变化就不再明显，可能是由于温度过高造成了色素的损失。

图9 超声时间和乙醇体积分数对吸光度的影响Fig.9 Effect of ultrasonic time and ethanol volume fraction on absorbance

图10 超声温度和乙醇体积分数对吸光度的影响Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on absorbance

图11 超声温度和超声时间对吸光度的影响Fig.11 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonic time on absorbance

结合图6～图11和表3中的F值可知，本试验中超声时间对提取效果的影响最大，且各个因素对试验结果的影响顺序由大到小依次为：超声时间>超声温度>乙醇体积分数>料液比。

2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证试验

通过Design Expert 8.0.6软件求解方程，可以得到最优的理论值是料液比1∶9.93，选择乙醇体积分数71.45%、超声时间17.52 min和超声温度71.26 ℃。考虑到做试验的实际情况，也为了方便操作，将理论最佳条件确定为1∶10的橘皮与乙醇之比，71%的乙醇浓度，71 ℃下超声18 min。

为了检验试验结果是否可靠，按照本试验操作流程在该条件下进行3次平行试验，测得的吸光度值求平均值为0.759，与响应面法预测的最优结果0.770基本吻合，因此采用响应面法对橘皮中黄色素的超声波提取工艺优化可行且效果较为良好。

3 结论

本试验采用超声波辅助提取橘皮中黄色素，通过常用提取溶剂的对比筛选确定乙醇为提取剂，在考察固液比(g/mL)、乙醇体积分数(%)、超声温度(℃)和超声时间(min)单因素的基础上进行响应面优化，得出橘皮粉末和70%的乙醇最佳比例是1∶10，最适合的乙醇体积分数为71%，最恰当的超声时间是18 min，超声温度在71 ℃时提取效果最好，在最优条件下提取的橘皮黄色素含量是17.8%，提取效果较好，为橘皮的综合加工开发提供了理论数据，为深入研发橘皮黄色素生产提供了理论技术指导。