水稻萌发期激素信号转导和谷胱甘肽代谢转录分析

崔欢 高巧丽 罗立新 杨靖 陈淳 郭涛 刘永柱 黄永相 王慧 陈志强,* 肖武名,*

水稻萌发期激素信号转导和谷胱甘肽代谢转录分析

崔欢1高巧丽1罗立新1杨靖1陈淳1郭涛1刘永柱1黄永相2王慧1陈志强1,*肖武名1,*

(1华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心，广州 510642；2广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江 524088；*通信联系人，E-mail：chenlin@scau.edu.cn；heredity24@126.com）

【】利用转录组测序技术，探究水稻萌发过程中激素信号转导和细胞内部氧化还原平衡的调控机理，以期增加对萌发过程中复杂调控机制的理解，促进萌发期基因组转录调控网络的构建，并挖掘调控种子萌发的相关基因，为水稻直播稻新品种选育提供理论参考。利用萌发0、24和48 h的种子进行动态转录组测序分析，以差异倍数≥2、错误发现率≤0.05为阈值筛选差异基因，并利用Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway数据库对萌发不同阶段的差异基因进行分析注释；同时利用实时荧光定量PCR对测序结果进行验证；最后运用String蛋白互作数据库以combined_score≥0.9为阈值分析差异基因的蛋白互作网络。在种子萌发前期鉴定到8719个差异基因，而在萌发后期仅鉴定到3480个。GO和KEGG富集结果均显示与激素信号转导相关的基因主要在萌发前期被诱导，特别是生长素信号转导途径中的GH3家族基因在萌发前期均受到显著诱导；而谷胱甘肽代谢途径中的基因在萌发后期转录更为活跃，其中谷胱甘肽-S-转移酶基因富集最多。此外，两个异柠檬酸脱氢酶基因在萌发过程中被显著诱导，经蛋白互作预测发现两个异柠檬酸脱氢酶基因与GH3家族基因可能存在相互作用。在种子萌发前期，生长素信号转导途径中的GH3家族基因可能在减弱生长素信号以及降低生长素活性方面发挥着重要作用，其高表达能降低生长素对种子的休眠作用，促进萌发启动；在种子萌发后期，谷胱甘肽代谢途径中的谷胱甘肽-S-转移酶基因可能在细胞抵抗氧化胁迫中发挥主要作用；此外，在整个萌发过程中，GH3和异柠檬酸脱氢酶家族基因的相互作用可能在实现激素转导途径和谷胱甘肽代谢途径的交互串联作用、共同调控种子萌发方面具有重要意义。

水稻；萌发；转录组；激素；谷胱甘肽

水稻是世界上最重要的农作物之一，世界上超过一半的人口以水稻为主食[1]。近年来，随着水稻免耕直播技术的广泛应用以及机插秧比例的不断增加，生产上对种子发芽特性的要求越来越高[2]。提高种子活力可以大幅缩短出苗时间，减小田间播种环境中的低温和低氧等不良因素对种子发芽的抑制作用，提高发芽率和出苗整齐度，从而提高群体质量，实现播种后的高产、稳产和优质[3, 4]。

种子萌发是水稻生命周期的起始阶段，开始于干种子吸水膨胀，结束于胚根的形成并突破种皮，决定了随后的成苗效果。一般而言，种子萌发过程可分为快速吸水阶段、吸水平台期和再次快速吸水三个阶段[5, 6]。先前研究表明，种子在快速吸水过程中，会因为膨胀过快、过度而出现损伤[7]，并且种子紧密的内部结构也会限制与外界环境的正常气体交流，从而导致萌发早期的种子出现氧化胁迫。因此，种子在萌发过程中会激活一系列胁迫相关基因的表达来保障萌发的正常进行[8]。蛋白组学分析揭示了水稻种子在吸水膨胀过程中发生的主要代谢活动，包括细胞完整性的修复、DNA损伤的修复、氧化还原以及丙酮酸代谢等[9-12]。同时，随着转录组测序技术（RNA-seq）的不断发展与应用，一系列与氧化还原、信号转导以及细胞壁完整性相关的基因在种子萌发过程中被鉴定出来[13, 14]。Chen等[15]在拟南芥种子萌发过程中发现编码抗坏血酸过氧化酶6（ascorbate peroxidase 6，APX6）能调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）信号来保护种子免受过度的氧化损伤，并能通过与激素信号的串联作用来促进种子萌发。He等[16]利用干种子和吸胀8 h的种子进行转录组测序，发现含有AP2（Apetala 2）结构域的转录因子在种子萌发初期的信号转导过程中可能起着重要调控作用。

众多研究表明，植物激素是调控种子萌发的重要因素，在种子萌发过程中激素信号转导途径会调节一系列蛋白质的合成与分解代谢，从而保证种子在合适的条件下启动萌发[17]。其中，脱落酸（ABA）是种子萌发过程中的关键信号因子之一，其主要通过调节细胞壁的松动和膨胀来抑制种子萌发[18]。同时，ABA也能促进茉莉酸（JA）的生物合成来协同抑制种子萌发[19]。种子对ABA的敏感性决定了种子的发芽速率[20]，主要受ABA信号通路上PYR/PYL(pyrabactin resistance 1 / pyrabactin resistance 1-like)受体等3个核心组件的调控[21, 22]。Song等[23]发现基因能增强转录因子与启动子的结合活性，促进ABA的信号转导，从而抑制种子萌发。一般而言，生长素（AUX）能通过刺激ABA信号转导来促进种子休眠，在萌发过程中也发挥着重要调控作用[24]。He等[25]利用构建的日本晴水稻突变体，发现水稻吲哚乙酸糖基转移酶基因能通过调节种子萌发过程中AUX和ABA的含量，引起下游ABA信号因子表达变化，从而决定水稻种子活力水平。有研究表明，乙烯（ET）和油菜素内酯（BR）在种子萌发过程中可能起着促进作用[26]。

种子萌发是一个复杂的生理生化过程。目前，关于种子萌发过程中的基因表达调控已有诸多研究，但是信号转导的准确调控机制以及氧化还原平衡如何稳定维持等问题仍然有待探索。本研究利用萌发0 h、24 h和48 h的种子进行动态转录组测序分析，以探索水稻种子萌发过程中不同发育阶段的基因表达变化，旨在揭示不同萌发阶段起主要调控作用的生物学途径，并挖掘在萌发过程中起重要调控作用的关键基因。

1 材料与方法

1.1 实验材料与处理

供试材料为美国直播稻品种Francis，由华南农业大学国家植物航天育种技术研究中心收集。种子先用70%乙醇浸泡20 min进行表面消毒，后于10%的次氯酸钠溶液中深度消毒30 min，蒸馏水洗涤三次后均匀放在铺有两层滤纸的直径9 cm的培养皿中（加入10 mL蒸馏水），置于培养箱（25℃、12 h光照/12 h黑暗、湿度85%）中进行萌发。分别取萌发0 h（C0）、24 h（C1）和48 h（C2）三个阶段的种子，30粒为1个重复，每个阶段各取3个重复，用液氮快速冷冻后置于−80℃下保存备用。称取冷藏的种子0.2 g，参照艾德莱试剂盒（AIDLA. RAN53）的指导说明书进行水稻总RNA提取。

1.2 测序文库的构建与测序

测序文库的构建与测序样品检测合格后，在北京百迈客生物科技有限公司用IIIuminaHiSeq平台对构建合格的测序文库进行双末端测序。

1.3 测序结果质量分析

分别将各样品的Clean Reads与指定的参考基因组（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）进行序列比对；获得唯一比对上参考基因的reads（unique reads）；统计unique reads在参考序列上的分布情况及覆盖度，判断比对结果是否通过第二次质控，判断合格的高质量reads用于后续生物信息学分析。

1.4 差异表达基因的筛选与功能注释

运用DESeq2软件，以差异倍数（Fold Change，FC）≥2、错误发现率（False Discovery Rate，FDR）≤0.05为阈值，筛选出两样本间的差异表达基因（Differentially Expressed Gene，DEG），对基因表达模式进行上（下）调描述和统计。FDR值是通过对差异显著性值（-value）进行校正得到的。

对筛选的差异基因运用ClusterProfiler分别进行生物学过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cell Component，CC）的富集分析，并进行GO基因功能注释，获得所有差异表达基因的功能注释、生物学功能以及相关的代谢途径，并以值（-value）≤0.05为阈值找出显著富集的分子条目。同时，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库，对筛选的差异基因进行通路（Pathway）定位和注释分析，以≤0.05为阈值找出显著富集的通路，进一步解读基因的功能。

1.5 实时荧光定量PCR验证

分别采用艾德莱AIDLA.RAN53试剂盒和Promega公司的GoScript™ Reverse Transcription System试剂盒提取总RNA并合成cDNA。在StepOne plus定量PCR仪上（美国ABI公司）开展实时定量PCR分析，所用试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)以及基于SYBRGreen染料法的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒。以（）基因为内参，引物序列信息如表1所示，定量数据处理参照Schmittgen等[27]的方法，每个基因进行3次生物学重复。

1.6 蛋白互作预测

利用String蛋白质互作数据库(https://string- db.org/）中的互作关系以combined_score≥0.9为阈值分析差异基因蛋白互作网络，并运用Cytoscape软件绘制蛋白互作网络图。

2 结果与分析

2.1 不同阶段DEG的鉴定和表达分析

在种子萌发过程中，总共鉴定到10 379个DEG。在萌发前期（C0 vs C1），共有8719个基因差异表达，其中4863个基因表达上调，3856个基因表达下调（图1-A）；在萌发后期(C1 vs C2)，共鉴定到3480个DEG，其中有2185个基因表达上调、1295个基因表达下调（图1-B）。萌发前期的差异基因数量显著多于后期，尤其是前期表达上调的基因明显多于表达下调的基因和后期表达上调的基因。共有1820个基因在萌发的两个阶段持续差异表达（图1-C），其中703个持续上调表达，344个持续下调表达（图1-D），它们可能在萌发过程中持续发挥重要作用。此外，有560个差异表达基因在萌发前期表达显著上调，而在萌发后期又显著下调，还有部分基因在萌发前期表达量显著上升，而在萌发后期又显著下降，暗示它们可能在萌发的不同阶段发挥着不同的作用。

表1 差异表达基因qRT-PCR验证引物

2.2 不同阶段DEG的GO富集分析

为了了解水稻种子在萌发过程中DEG的主要功能特征，分别对每一阶段的DEG进行GO显著性富集分析。萌发前期共富集了37个GO分子条目，其中生物学过程、细胞组分和分子功能分别富集到21、13和3个条目（图2-A）；在萌发后期，分别富集到28、19和30个条目（图2-B）。

在萌发过程中，细胞氧化剂排毒、过氧化氢分解过程、氧化还原过程、氧化应激反应、几丁质分解代谢过程以及基于微管的运动共6个生物学过程的条目在种子发育的两个阶段均显著富集。在萌发前期，显著富集到的主要包括脂肪酸生物合成过程、以DNA为模板的转录调控、DNA复制起始、对脱落酸的反应以及细胞周期等分子条目，主要与DNA复制、转录以及激素信号转导等生物学过程有关。在种子发育后期，显著富集到的生物学过程的条目主要涉及物质的合成与分解代谢、光合作用以及氧化还原等生物学过程，主要包括谷胱甘肽代谢过程、糖酵解过程以及跨膜转运等。对分子功能进行分析后发现，在种子萌发前期只显著富集到了金属离子结合、过氧化物酶活性和脂质结合3个功能条目；而在种子萌发的后期，主要富集在几丁质酶活性、过氧化物酶活性、谷胱甘肽转移酶活性以及氧化还原酶活性等分子功能条目。

2.3 不同阶段DEG的KEGG富集分析

为了探究水稻种子在萌发过程中的代谢途径变化，利用KEGG数据库对DEG进行了功能分类和通路注释分析。由图3可知，在萌发前期有4条KEGG通路显著富集，在萌发后期有22条KEGG通路显著富集，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与半胱氨酸和蛋氨酸代谢两条氨基酸代谢途径在两个阶段均显著富集。在萌发前期富集到

差异基因最多的通路是植物激素信号转导途径；而在萌发后期显著富集的代谢通路主要包括碳代谢、淀粉和蔗糖代谢与谷胱甘肽代谢等13条代谢途径，苯丙烷生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等4条生物合成途径，糖酵解/糖异生以及与光合作用有关的2条途径等。

2.4 激素信号转导途径基因的表达模式分析

种子萌发过程中，在植物激素信号转导途径中共富集到与生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、茉莉酸和水杨酸在内的8大类激素转导相关的107个DEG，其中在萌发前期富集到87个DEG，且58个基因的表达水平相比于干种子均显著上调(图4)。萌发后期富集到的基因明显少于前期，只有38个，其中上调基因占24个。

A−萌发前期差异基因MA图；B−萌发后期差异基因MA图；C−萌发期差异基因韦恩图；D−萌发期上（下）调差异基因韦恩图。

C0−萌发后0 h; C1−萌发后24 h; C2−萌发后48 h。

A, MA map of DEG in early germination; B, MA map of DEG in late germination; C, Venn diagram of DEG in germination stage; D, Venn diagram of up-regulation and down-regulation DEG in germination stage.

C0, 0 h after germination; C1, 24 h after germination; C2, 48 h after germination.

图1 不同萌发阶段差异表达基因分析

Fig. 1. Differentially expressed gene analysis during different germination stages.

在种子萌发前期，与生长素转运相关的4个基因均被显著诱导，而生长素响应因子ARF(auxin response factor)基因更是上调10倍以上。生长素信号转导的负调控因子Aux／IAA(auxin/indole acetic acid)、具有吲哚乙酸氨基酸化合成酶功能的GH3(Gretchen Hagen 3)相关基因以及编码钙调素结合蛋白的SAUR(small auxin up RNA)基因也大部分显著上调表达，且在24 h表达上调的基因更为集中。说明在种子萌发前期，生长素信号转导途径中起负调控作用的基因转录更为活跃，生长素信号转导强度在萌发期间可能有所降低。与AUX相关基因表达趋势不同的是，ABA信号转导途径中的亚类Ⅲ蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶2(subclass Ⅲ sucrose nonfermenting-1-related protein kinase2，SnRK2)、A组2C类蛋白磷酸酶(group A type 2C protein phosphatase，PP2C)以及转录因子ABF(ABA-responsive element binding factor)相关基因的表达在种子吸胀后表达呈现明显下降趋势，暗示在种子萌发过程中与ABA信号转导相关基因的转录受到明显抑制。而ABA受体PYR/PYL基因在萌发前期表达量上升而在后期表达量又明显下调，表明ABA信号转导可能主要发生在种子萌发前期。ET信号转导的负调控器CTR1相关的基因表达上调，而乙烯信号转导的关键因子EIN2相关的基因以及下游的正调控器EIN3基因均表达下调，暗示种子萌发过程中对ET敏感性有所降低。

图2 萌发前期(A)和萌发后期(B)差异表达基因GO富集分析

Fig. 2. GO enrichment plots of differentially expressed genes at early(A) and late(B) germination stages.

C0−萌发后0 h; C1−萌发后24 h; C2−萌发后48 h。

Fig. 3. KEGG enrichment plots of DEGs at different germination stages.

图4 植物激素信号转导途径基因表达热图

Fig. 4. Heatmap of DEGs expression in hormone signal transduction pathways.

其他植物激素中，6个与BR信号转导有关的基因在萌发前期均显著上调，而在萌发后期的表达水平与前期相比无明显变化，表明BR在整个萌发过程中可能起促进作用，且主要在前期响应萌发信号。CK、JA和SA信号途径相关基因表达整体呈上升趋势。与大部分激素信号转导相关基因在萌发前期出现显著上调的表达趋势不同的是，CK信号转导相关的基因在萌发后期比前期表达上调更为显著和集中，可能与后期活跃的细胞扩增有十分密切的关系。

2.5 谷胱甘肽代谢途径基因的表达模式分析

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）能猝灭细胞中的活性氧物质，是一种在植物中普遍存在的抗氧化剂。在种子萌发过程中总共有44个DEG富集在谷胱甘肽代谢途径上，在萌发前期富集到28个DEG，包括13个上调表达的基因；在萌发后期富集到23个差异基因，且大部分基因的表达水平相比前期均呈显著上升趋势（图5）。在萌发期间共有7个基因持续差异表达，其中有4个基因持续上调表达，包括2个GST基因。2个异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）基因在萌发前期的表达量相较于干种子均显著上升，上调倍数更是达到了36倍以上。说明ICDH催化NADPH生成NADP+的同时释放的能量可能在种子萌发前期发挥着重要的作用。该途径中富集到的编码谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）的基因最多，达到23个，且大部分在萌发过程中被显著诱导。此外，谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GS)和谷胱甘肽水解酶相关基因在萌发后期也均被显著诱导，谷胱甘肽代谢途径相关基因在种子萌发过程中进行了积极响应，在萌发前期与后期上调和下调的基因有所不同。

2.6 激素信号转导与谷胱甘肽代谢途径对萌发的交互调控

运用String蛋白互作预测数据库，将107个与激素信号相关的DEG和44个谷胱甘肽代谢途径中的DEG进行蛋白互作预测，以combined_score≥0.9为阈值得到了如图6所示的互作网络图。图中共有10个簇，其中9个簇显示的是与激素信号相关基因之间的互作关系，包括生长素转录因子基因（MP）与（IAA13）以及（IAA30）这两个AUX/IAA转抑制子基因之间的互作关系。前人研究表明，在生长素信号转导的过程中，AUX/IAA蛋白对转录因子ARF具有抑制作用，能够限制生长素响应基因的表达[28]。有趣的是，谷胱甘肽代谢途径中的ICDH家族中的两个基因（OsJ_02861）和（OsJ_19624）与生长素早期应答基因GH3家族的8个基因可能存在相互作用，结果表明植物激素信号转导与谷胱甘肽代谢途径可能通过ICDH和GH3家族基因实现串联，在种子萌发中存在交互调控机制。

图5 谷胱甘肽代谢途径基因表达热图

Fig. 5. Heatmap of DEGs expression in glutathione metabolic pathway.

图6 激素信号途径基因与谷胱甘肽代谢途径基因互作预测网络图

Fig. 6. Predicted interaction networks between hormone signaling transduction pathways and glutathione metabolic pathways.

C0−萌发后0 h; C1−萌发后24 h; C2−萌发后48 h。

Fig. 7. Expression patterns of selected DEG were verified by qRT-PCR.

2.7 部分DEG表达模式的qRT-PCR验证

为了验证转录组测序数据是否可靠，从鉴定到的GH3和GST两个家族的差异基因中各自随机挑选了4个进行了qRT-PCR验证。结果表明8个DEGs的差异倍数虽然和测序结果不是完全一致，但是表达趋势与测序结果均一致（图7），表明转录组结果数据可靠。

3 讨论

种子萌发是一个复杂的生物过程，干种子吸水后会启动一系列转录活动，基因表达十分活跃。在本研究中，种子萌发前期的DEG显著多于萌发后期，且大部分基因表达上调，暗示干种子吸水后，基因的表达量会显著升高，且主要发生在萌发的前24 h，与前人研究结果基本一致[14]。GO富集发现，过氧化氢分解、对氧化应激的反应等生物学过程在整个萌发过程中均被显著富集，说明在萌发过程中，氧化胁迫相关基因发挥着重要的作用。萌发前期被显著富集的DEG主要与转录调控、DNA复制、对脱落酸的反应以及细胞周期等功能相关，说明萌发前期是基因转录以及信号分子发生剧烈变化的重要时期，该时期信号的转导以及相应物质的准备决定着种子是否可以顺利打破休眠，启动萌发。在萌发后期，种子的转录应答主要涉及到物质的合成与分解代谢、光合作用以及氧化还原等生物学过程，可能与种子出芽阶段的大量物质与能量需求有关。KEGG富集结果表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与半胱氨酸和蛋氨酸代谢两条氨基酸代谢途径十分活跃，能为种子生命活动的进行提供充足的氨基酸，且其代谢产物也能为其他代谢途径提供部分物质和能量支持，可能在种子萌发过程中起着举足轻重的作用。萌发前期富集到DEG最多的通路是植物激素信号转导途径，表明与激素信号转导相关的基因在种子萌发前期的信号响应中可能发挥着重要作用；而谷胱甘肽代谢途径在萌发后期比前期富集更为显著，则暗示在种子萌发后期可能仍旧存在着较为严重的氧化胁迫。

植物激素信号转导途径在种子萌发过程中起着重要的调控作用，其中，ABA和AUX均能通过特定的信号转导途径抑制种子萌发。在本研究中，与激素信号转导相关的基因在种子萌发前期被显著富集，暗示激素信号的转导主要发生在种子萌发前期，并可能参与了种子前期的应激反应途径。在ABA信号转导途径中，PYR/PYL受体能间接调控SnRK2的活性[29]；同时，当ABA与PYR/PYL受体结合后能触发受体的构象变化，从而使受体-ABA复合物与PP2C结合并抑制其活性[30]。在本研究中，ABA受体PYR/PYL基因在萌发前期受到显著诱导，而和基因在种子吸胀后均表达下调，另外8个转录因子在萌发过程中的转录也均受到明显抑制，表明在萌发过程中ABA信号转导减弱，ABA对萌发的抑制作用显著降低。生长素信号转导通路主要由生长素受体TIR1/AFB、转录抑制子AUX/IAA以及转录因子ARF三种因子组成[31]。在拟南芥中，基因的表达量下调会导致种子休眠水平的降低，加快萌发速率[24]。本研究中，仅鉴定到一个基因，其在吸胀后表达量大幅上升，而在生长素信号途径中鉴定到的和相关差异基因数量较多，且大部分表达显著上调，暗示在种子吸胀过程中，生长素信号转导可能受到抑制，基因和可能共同调控生长素早期响应基因的表达。GH3家族中鉴定到的8个DEG在萌发前期均受到显著诱导，、、和更是上调8倍以上。GH3蛋白能降低细胞中游离的生长素活性，抑制生长素信号转导，可能在种子萌发早期能降低生长素对种子的休眠调控作用，促进种子萌发[32]。在本研究中，转录组数据显示，种子萌发过程中乙烯信号转导可能受到抑制，与前人报道不同[26]，这可能与不同的测试材料以及分析时期有关。

谷胱甘肽（GSH）能帮助维持细胞抗氧化防御，并且在调节细胞内氧化还原信号转导中有着举足轻重的作用，是一种在植物体内普遍存在且极为重要的抗氧化物质[33]。GST是具有多种功能的蛋白质家族，它们在酶促ROS清除机制中起重要作用，能以GSH为底物催化H2O2的转化，从而产生氧化型谷胱甘肽（GSSG），GST过表达有助于提升非生物胁迫耐受性[34]。本研究在谷胱甘肽代谢途径中富集到的23个编码GST的DEG，且大部分在萌发过程中被显著诱导，暗示GST家族基因可能通过维持细胞内的氧化还原平衡而在种子萌发过程中发挥作用。此外，和这两个基因在萌发过程中受到显著诱导。ICDH可以通过三羧酸循环为细胞质提供α-酮戊二酸，同时也可以产生谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶的重要辅酶NADPH，与植物体内的ROS清除密切相关[35, 36]。两个基因在萌发过程中持续表达上调，说明它们可能与萌发过程中细胞内氧化还原平衡的稳定维持以及能量代谢密切相关，在促进种子萌发过程的顺利进行方面起着重要作用。谷胱甘肽代谢可能通过影响GSH/GSSG比率来平衡细胞中的ROS含量、催化H2O2的转化，保护细胞免受氧化所导致的损伤；同时，其也可能通过合成与分解代谢参与调节细胞中的谷氨酸、半胱氨酸的含量，为其他代谢途径提供部分物质基础，在萌发过程中具有重要作用[37]。富集结果显示在种子萌发前期和后期谷胱甘肽代谢途径均被显著富集，且在萌发后期富集更为显著，暗示其在种子萌发的整个过程中起着重要的调控作用，尤其在保障种子从露白到发芽阶段的顺利过渡方面有着重要贡献。

先前研究表明，植物激素信号转导途径和谷胱甘肽代谢途径可能存在着多方向的交互作用，以保障植株对胁迫的有效应对[38, 39]。在拟南芥中，ABA能影响ROS的浓度[40]；而在水稻中，SA能调节GSH的浓度和GR的活性[41]。因此，本研究利用富集到的植物激素信号转导途径和谷胱甘肽代谢途径中的差异基因进行了初步的蛋白互作预测，结果表明，GH3家族的基因和ICDH家族的两个基因可能存在相互作用，它们可能将两个代谢通路交互串联起来，在水稻种子萌发过程中共同作用，确保种子萌发的顺利进行。

4 结论

本研究利用RNA-seq技术对水稻干种子（0 h）、吸胀种子（24 h）以及发芽种子（48 h）进行了动态转录组分析。结果发现，植物激素信号的转导主要发生在种子萌发前期，其中生长素信号转导途径中的GH3家族基因可能在降低游离生长素活性以及减弱生长素信号方面发挥着重要作用，其高表达能降低生长素对种子的休眠作用，促进种子萌发。而谷胱甘肽代谢途径中的谷胱甘肽-S-转移酶基因可能在种子萌发后期抵抗细胞氧化胁迫中发挥主要作用，并且萌发过程中该途径里的异柠檬酸脱氢酶基因的高表达可能在实现与植物激素信号转导途径的串联交互作用、共同调控种子萌发方面具有重要意义。

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Transcriptome Analysis of Hormone Signal Transduction and Glutathione Metabolic Pathway in Rice Seeds at Germination Stage

CUI Huan1, GAO Qiaoli1, LUO Lixin1, YANG Jing1, CHEN Chun1, GUO Tao1, LIU Yongzhu1,HUANG Yongxiang2, WANG Hui1, CHEN Zhiqiang1,*, XIAO Wuming1,*

(1National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2Binhai Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China;*Corresponding author, E-mail: chenlin@scau.edu.cn; heredity24@126.com)

【】By using transcriptome sequencing technology, we explored the regulation mechanism of hormone signal transduction and redox balance inside cells during rice germination, as a way to increase the understanding of and construct the complex regulatory network of germination.At the same time, mining the genes that regulate seed germination could lay a theoretical basis for direct-seeded rice breeding.【】Dynamic transcriptome sequencing analysis was performed using seeds at 0, 24, and 48 hours after imbibition as materials. Differentially expressed genes (DEGs) were screened with the threshold of Fold Change≥2 and False Discovery Rate≤ 0.05. Gene Ontology and KEGG Pathway databases were used to analyze and annotate the DEGs at different stages of germination and real-time quantitative PCR was conducted to verify the sequencing results. Finally, the protein interaction network of DEGs was analyzed using the String protein interaction database under the threshold of combined_score≥0.9.【】8719 DEGs were identified in the early stage of seed germination, but only 3480 DEGs in the late stage of germination. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the DEGs related to hormone signal transduction were mainly induced in the early stage, especially the GH3 (Gretchen Hagen 3) family genes in the auxin signal transduction pathway were all significantly induced after imbibition. While the DEGs involved in the glutathione metabolism pathway were more active during the late germination period, and the glutathione-S-transferase genes were the most enriched in this pathway. In addition, two isocitrate dehydrogenase (ICDH) genes were significantly induced throughout the germination process. According to protein interaction prediction, the two ICDH genes may interact with the GH3 family genes.【】The GH3 family genes in the AUX signal transduction pathway may play an important role in attenuating the AUX signal and reducing the AUX activity in the early stage of seed germination. Their high expression levels reduce the regulatory effect of auxin on seed dormancy and promote seed germination. In the glutathione metabolism pathway, GST genes may play a major role in resistance to cell oxidative stress in the late stage of seed germination. In addition, the interaction between GH3 and ICDH family genes during the germination process may have important significance in realizing the tandem effect of hormone transduction pathway and glutathione metabolism pathway and co-regulating seed germination.

rice; germination; transcriptome; hormone; glutathione

10.16819/j.1001-7216.2021.200915

2020-09-23；

2021-03-04。

国家自然科学基金资助项目(31872885)；广东省重点领域研发计划项目(2020B020219004)；国家重点研发计划资助项目(2017YFD0100100)。