复合玛咖片的毒理学安全性评价

张 悦 张朋朋 孟庆金 董 鹏 杨彩玲 王学南 张 鹏 田世民,

玛咖是十字花科独行菜属一年生或两年生草本植物，原产于秘鲁，是南美洲安第斯山地区常用的药食两用植物之一[1]。研究发现，玛咖中存在多种活性物质，包括吗卡多糖、玛咖生物碱、玛咖芥子油苷、玛咖黄酮等，具有增强免疫力、缓解体力疲劳、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、降血糖及神经保护等功效[2]。黄芪属植物在我国超过200余种，是我国传统的中药材，主要活性成分有黄酮、三萜及生物碱等，具有抗菌、炎症抑制、抗氧化、降脂、免疫调节、抑制肿瘤细胞增殖等功效[3]。沙苑子是豆科植物扁茎黄芪干燥成熟的种子，也是我国传统的中药材，主要含有有黄酮、三萜、氨基酸等活性成分，具有护肝降脂、提高免疫力、抗氧化、耐疲劳等作用[4，5]。女贞子是女贞属植物的果实，最早在《神农本草经》中有记载，女贞属植物主要含有主要含有萜类、苯乙醇类、黄酮类等成分，具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎及保肝等功效[6]。黄精为百合科黄精属多年生草本植物的干燥根茎，是我国传统中药材，含有黄精多糖、皂苷、生物碱、黄酮、蒽醌类化合物、氨基酸、微量元素等多种活性物质，具有免疫调节、抗疲劳、降血糖、降血脂、抗氧化、改善记忆、抗肿瘤等多种功效[7，8]。

复合玛咖片以玛咖粉、黄芪提取物、沙苑子提取物、女贞子提取物、黄精提取物为主要原料制备的片剂保健食品，具有缓解体力疲劳功效。本研究按照《保健食品检验与评价技术规范》对复合玛咖片进行安全性评价，为其作为保健食品的食用安全性提供实验依据。

1.实验材料

1.1 受试物 复合玛咖片，规格：0.5g/片×60片/瓶，人体推荐食用方法及食用量：口服，每日2次，每次3片。

1.2 实验动物及菌株 SPF级ICR小鼠、SD大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016—0011。动物饲养管理条件：温度20～26℃，湿度40%～70%，光照12h明暗交替。动物饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证号：SCXK(京)2014—0010。本单位实验动物使用许可证号：SYXK(京)2016—0011。鼠伤寒沙门菌株TA100购买自广东省微生物菌种保藏中心，TA97a、TA98、TA102购买自MOLTOX公司。

1.3 主要仪器与试剂 血液分析仪(雅培CELL-DYN3700)，全自动生化仪(东芝TBA-120FR)，电子天平(Sartorius BS 223S，Sartorius BSA2202s-cw，METTLER ME203E/02)，离心机，显微镜(奥林巴斯CX31)，石蜡切片机，脱水机等。

肝S9购买自MOLTOX公司，批号：3745；敌克松(Dexon)购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号：40709；叠氮钠(SA)购自Amresco公司，批号0639；2-氨基芴(2-AF)购自Sigma公司，批号：AG310001；1,8-二羟基蒽醌(1,8-DHQ)购自ACROS公司，批号：A0248756；环磷酰胺(CP)购自Sigma公司，批号：WXBC4021V。

2.实验方法

2.1 急性毒性实验 选用20只健康小鼠，雌雄各半，体重18～22g，采用最大耐受剂量法(MTD)进行实验。实验前禁食不禁水16h，给受试物当日标记、称重，称取受试物7.5g，加适量去离子水充分混悬后定容至25ml，采用24h内两次经口灌胃，灌胃间隔4h，单次灌胃体积为30ml/(kg·BW)，合计灌胃剂量为18.0g/(kg·BW)。末次灌胃2h后给予饲料；灌胃后0.5h、2h观察，其后每天观察1次、连续观察14天，记录动物中毒表现和死亡情况。

2.2 Ames实验 采用经鉴定符合要求的组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个菌株进行实验。实验设置5个剂量组，终剂量浓度依次为62μg/皿、185μg/皿、556μg/皿、1667μg/皿、5000μg/皿。采用平板掺入法：在顶层琼脂(2ml，45℃)中依次加入0.1ml供试菌液、0.1ml受试物溶液，需代谢活化时另加入0.5mlS9混合液，充分混匀后迅速倾入底层培养基上，37℃培养48h后计数每皿回变菌落数。每个剂量设置3个平行皿，整个实验在相同条件下开展2次。

2.3 骨髓细胞微核实验 选用50只健康小鼠，体重25～30g，随机分为5组，雌雄各半。实验设置3个剂量组，按照一次最大灌胃剂量设置高剂量为6.0g/(kg·BW)，中剂量为3.0g/(kg·BW)，低剂量为1.5g/(kg·BW)，受试物以去离子水为溶剂，按20ml/(kg·BW)灌胃。采用30h两次给予受试物法，即间隔24h两次经口灌胃，第二次给予受试物后6h，脱颈处死动物，取股骨骨髓用小牛血清稀释后涂片，甲醇固定，Giemsa染色。显微镜检，计数每只动物200个红细胞(RBC)中嗜多染红细胞数(PCE)，计算所占比例；每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，其微核发生率以千分率计。实验同时设置溶剂对照组、环磷酰胺阳性对照组[60mg/(kg·BW)]。

2.4 小鼠精子畸形实验 选用25只健康雄性小鼠，体重25～35g，随机分为5组。实验设置3个剂量组，按照一次最大灌胃剂量设置高剂量为6.0g/(kg·BW)，中剂量为3.0g/(kg·BW)，低剂量为1.5g/(kg·BW)，受试物以去离子水为溶剂。按20ml/(kg·BW)灌胃，连续5天经口灌胃，首次给予受试物后第35天，脱颈处死动物，取双侧附睾放入生理盐水中，剪碎，四层擦镜纸过滤，取滤液涂片，甲醇固定，2%伊红染色。显微镜检，每只动物计数1000个精子，并计算精子畸形发生率，以千分率计。

2.5 30天喂养实验 选用SD大鼠80只，体重60～80g，随机分为4组，每组20只，雌雄各半，1.25g/(kg·BW)、2.5g/(kg·BW)、5.0g/(kg·BW)，相当于人体推荐剂量的25倍、50倍、100倍，另设溶剂对照组，连续经口灌胃30天喂养。实验期间每周称量动物体重1次，摄食2次，并计算动物增重及食物利用率。连续喂养30天后，过夜禁食16h后称重、麻醉，腹主动脉采血，进行血常规和血生化测定，并对动物进行大体解剖及组织病理学检查。

2.6 统计学方法 实验数据采用SPSS软件进行统计分析。微核率和精子畸形率使用χ2检验进行分析，其他各指标均使用单因素方差分析(ANOVA)进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1 急性毒性实验 受试物以18.0g/(kg·BW)的剂量经口灌胃给予雌、雄性ICR小鼠，连续观察14d，动物粪便、体毛、活动正常，动物体重变化未见异常，实验期间未见其他明显的动物中毒症状和死亡。结果表明该受试物对雌、雄性ICR的急性经口毒性最大耐受剂量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)。

3.2 遗传毒性实验

3.2.1 Ames实验：各处理组平板背景菌苔未见异常。受试物各剂量组回变菌落数均未超过未处理对照菌落数2倍，不同剂量组间无剂量-反应关系，两次结果一致；在加和不加S9条件下，均未见受试物对TA97a、TA98、TA100、TA102四株菌有致突变作用。

3.2.2 骨髓细胞微核实验：由表1可见，受试物各剂量嗜多染红细胞(PCE)与红细胞百分比未少于溶剂对照组的20%，表明受试物在实验剂量下无明显细胞毒性；受试物各剂量组的微核发生率与溶剂对照组相比，均无统计学差异(P>0.05)；提示该受试物对小鼠骨髓细胞无致微核作用。

表1 受试物对小鼠骨髓微核发生率的影响

3.2.3 小鼠精子畸形实验：由表2可见，与溶剂对照组相比，受试物各剂量组均未见精子畸形发生率有统计学差异(P>0.05)，提示受试物对小鼠无致精子畸形作用。

表2 受试物对小鼠精子畸形发生率的影响

3.3 30天喂养实验

3.3.1 受试物对大鼠体重、摄食的影响：不同剂量连续经口灌胃SD大鼠30天，雌、雄性大鼠的周体重和摄食量逐周增加，周体重增重与周食物利用率逐周减少(表3)，由此说明大鼠体重与摄食量成正相关，大鼠的体重与食物利用率成负相关。与对照组相比，雄性动物中剂量组第4周动物平均体重较轻，表现出统计学差异(P<0.05)。受试物各剂量组各周摄食量、周平均食物利用率与对照组相比，均无统计学差异(P>0.05)。

表3 受试物对大鼠体重、摄食的影响

3.3.2 受试物对大鼠血液生化指标的影响：雌性动物低剂量组动物白细胞计数较对照组偏高，高剂量组白细胞其他分类较对照组偏低，均表现出统计学差异(P<0.05)；雄性动物低剂量组红细胞计数及淋巴细胞较对照组有所升高，中性粒细胞较对照组偏低，均表现出统计学差异(P<0.05，P<0.01)，其他各指标在不同剂量组与对照组间比较，均无统计学差异(P>0.05)，结果见表4。雌性动物受试物低剂量组血糖较对照组偏低，并表现出统计学差异(P<0.05)，其他各指标在不同剂量组与对照组间比较，均无统计学差异(P>0.05)，结果见表5。

表4 受试物对大鼠血常规的影响

续表4

表5 受试物对大鼠血液生化学指标的影响

3.3.3 大体解剖及组织学病理检查：大鼠大体解剖肉眼观察，高剂量组雄性1例动物可见睾丸萎缩，其余各剂量组肝、肾、脾、胃肠、睾丸或卵巢脏器未见明显异常，取对照组和高剂量组雌性及雄性动物相关组织进行病理学检查。对照组有雌性1例、雄性2例，高剂量组有雌性2例、雄性2例肝细胞索之间和(或)汇管区偶见轻微的灶性单核细胞浸润，该病变属SD大鼠常见的自发性改变；另外对照组雌性1例，高剂量组雌性2例发生轻微脂肪性变。高剂量组1例动物睾丸萎缩，镜检可见生精上皮层次减少，生精小管未见成熟精子，间质细胞增生，被膜增厚。肾脏、脾脏、胃、十二指肠、卵巢均未见异常。

4.结论

本研究对以玛咖粉、黄芪提取物、沙苑子提取物、女贞子提取物、黄精提取物为主要原料制备的保健食品复合玛咖片进行了毒理学研究，急性毒性实验结果显示该受试物对ICR小鼠的急性经口毒性最大耐受剂量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)，属于实际无毒级。Ames实验、骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验结果均为阴性，显示本实验条件下该受试物无遗传毒性。30天喂养实验结果表明，受试物复合玛咖片各剂量组实验期间雌、雄性动物生长状况良好，未见受试物对动物体重、增重及食物利用率产生不良影响，个别指标差异无剂量-反应关系，结合临床观察及病理诊断结果综合分析，不认为有生物学意义。未见受试物对动物血液学、血生化相关指标产生不良影响，个别指标差异无剂量-反应关系，指标检测结果均在本实验室历史对照范围内，结合临床观察及病理诊断结果综合分析，不认为有生物学意义。大体解剖检查，各剂量组动物均未见脏器明显异常，不认为受试物对被检脏器湿重、脏体比产生不良影响，个别指标差异无剂量-反应关系，指标检测结果均在本实验室历史对照范围内，结合临床观察及病理诊断结果综合分析，不认为有生物学意义。组织病理学检查，未见被检脏器存在与受试物相关的组织病理学改变。本研究结果显示，复合玛咖片在本实验条件下未见明显的毒性作用，为复合玛咖片作为保健食品的进一步开发提供毒性实验依据。