miR-16-5p对食管鳞癌的诊断价值和作用机制研究

冯巧燕 张波 张健 徐建峰

食管癌是世界第七大常见的癌症，其中食管鳞状细胞癌（以下简称食管鳞癌）约占90%[1]。由于其发病隐匿，多数患者初次诊断时已经处于疾病晚期。早期食管癌患者的术后5年生存率为80%～90%，而晚期患者仅为25%[2]。由此可见，食管癌的早期诊断至关重要。活体组织病理检查是癌症诊断的金标准，但这种诊断方法不方便且具有侵入性。因此，寻找合适的生物标志物辅助肿瘤早期诊断意义重大。microRNA（miRNA）是长度约22个核苷酸的非编码RNA，通过降解靶mRNA或阻断其翻译从而调控基因表达[3]。研究表明，特定miRNA的表达异常对肿瘤增殖、血管生成和转移起关键作用[4-5]。不同类型肿瘤的miRNA表达谱不尽相同，这种情况不仅存在于患者肿瘤组织内，患者的血液、唾液等miRNA表达水平也可能发生改变[6-7]。因此，检测特定miRNA是否发生改变可能对食管癌诊断具有一定的指导作用。基于此，本研究通过基因表达汇编（gene expression omnibus，GEO）数据库探寻食管鳞癌患者和健康人群血清中差异表达的miRNA；通过qRT-PCR实验对浙江省台州医院的35例食管鳞癌患者的血清与健康人群血清中的miR-16-5p进行检测和分析，并通过ROC曲线评估miR-16-5p作为食管鳞癌生物标志物的潜在可能；下载癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据分析miR-16-5p在食管鳞癌组织中的表达，初步分析其作用机制，以期为miR-16-5p成为食管鳞癌生物标志物提供理论支持，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 采集浙江省台州医院2015年9月至2019年6月收治的病理学检查确诊为食管鳞癌的35例患者的血液标本和35例健康体检者的血液标本，标本均由中心实验室规范保存。35例食管鳞癌患者中男27例，女8例；年龄＜60岁22例，≥60岁13例；肿瘤位于食管中段～中上段13例，中下段～下段22例；N0或Nx期21例，N1～2期14例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 GEO数据筛选 从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载 GSE71043数据集，共3例食管鳞癌患者血清和3例健康人血清的miRNA表达数据纳入本研究。通过GEO2R工具筛选食管鳞癌患者血清与健康人群血清中的差异表达miRNA。

1.2.2 血清miR-16-5p表达水平检测 受试者采用普通生化管抽取5 ml静脉血，在常温下3 000 r/min离心10 min（离心半径16 cm）获得血清标本，使用TRIzol试剂（美国赛默飞公司）提取血清标本中的总RNA。根据产品使用说明书使用miRNA逆转录试剂盒（美国赛默飞公司）制备cDNA。采用PCR试剂（上海吉玛公司）配制反应体系进行PCR扩增，以cel-miR-39为内参标准化，使用 2-ΔΔCt方法进行相对定量分析。miR-16-5p的上游引物：5'-GATCTTGAAGGGGACCGCAATGGA-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。cel-miR-39的上游引物：5'-CACTCCGTCACCGGGTGTAAATC-3'，下游引物：5'-TCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由上海生工生物有限公司（上海生工）合成。

1.2.3 TCGA数据分析 从TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）中下载食管鳞癌高通量基因测序数据和临床数据，共95例食管鳞癌组织和13例癌旁正常组织的miRNA表达数据纳入本研究。所有miRNA表达数据采用log2进行标准化处理。

1.2.4 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本体论（gene ontology，GO）富集分析 从miRTarBase数据库（http://mirtarbase.cuhk.edu.cn）下载miR-16-5p的靶基因。将靶基因上传至用于注释、可视化和集成发现的数据库（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）进行 EKGG 和GO功能富集分析。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者血清与健康人群血清miR-16-5p表达水平比较 GEO数据集数据分析结果和qRTPCR检测结果均显示食管鳞癌患者血清miR-16-5p表达水平明显高于健康人群血清，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

表1 食管鳞癌患者血清与健康人群血清miR-16-5p表达水平比较

2.2 miR-16-5p对食管鳞癌的诊断效能分析 利用Younden指数的ROC曲线得到能区分食管鳞癌患者与健康人群的截断值。miR-16-5p的灵敏度为0.7143，特异度为0.8857，此时最佳截断值为1.3351，AUC为0.802（95%CI:0.689～0.887），见图 1。

图1 miR-16-5p诊断食管鳞癌组织的ROC曲线

2.3 不同临床特征食管鳞癌患者血清miR-16-5p表达水平比较 35例食管鳞癌患者中，有淋巴结转移患者血清中miR-16-5p表达水平高于无淋巴结转移或淋巴结转移未知患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；但不同性别、年龄、吸烟史、饮酒史和肿瘤位置患者血清中miR-16-5p表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。

表2 不同临床特征食管鳞癌患者血清miR-16-5p表达水平比较

2.4 食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织miR-16-5p表达水平比较 TCGA数据分析结果显示食管鳞癌患者癌组织 miR-16-5p表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织miR-16-5p表达水平比较

2.5 miR-16-5p在食管鳞癌中的作用机制GO和KEGG富集分析结果 从miRTarBase数据库获取已经证实的1 557个miR-16-5p的靶基因，对这些靶基因进行富集功能富集分析。KEGG富集结果显示，miR-16-5p的靶基因显著富集于PI3K-Akt、p53、Hippo等多条肿瘤相关信号通路（P＜0.05），见表4。GO富集结果显示，miR-16-5p的靶基因显著富集于翻译、结合蛋白、细胞黏附等（P＜0.05），见表 5。

表4 miR-16-5p靶基因的KEGG信号通路富集结果

表5 miR-16-5p靶基因的GO富集结果

3 讨论

目前，食管癌仍是当今世界最具致命性的癌症之一。尽管预防与治疗食管癌的方法和手段有所改进，但对于中晚期食管癌，这些干预性措施疗效有限。寻找新型的诊断方法和合适的生物标志物显得尤为重要。本研究探讨了miR-16-5p在食管鳞癌患者血清和癌组织中的表达情况，并进一步分析其作用机制。

本研究结果显示，血清中miR-16-5p或可作为筛查食管鳞癌患者的生物标志物。与健康人群血清相比，食管鳞癌患者血清中的miR-16-5p水平显著上调，这一结论得到GEO数据分析结果的支持。ROC曲线分析结果显示血清中miR-16-5p检测食管鳞癌患者的AUC值为0.802，具备较高的灵敏度和特异度。同时，本研究还显示血清中miR-16-5p的表达与食管鳞癌进展有关，食管鳞癌患者血清中miR-16-5p的表达水平在有淋巴转移的患者中明显上调，但这需要扩大样本量进一步证实。另外，本研究显示食管鳞癌组织中miR-16-5p的表达水平显著上调，这表明miR-16-5p参与食管鳞癌的发生。KEGG和GO功能富集分析表明miR-16-5p可能通过调控翻译、结合蛋白、细胞黏附从而影响食管鳞癌的发生与发展，多条肿瘤相关信号通路或参与该过程。

一系列研究已经证明循环miRNA在各种癌症中的诊断价值。在众多的miRNA中，miR-16-5p是最具代表性的miRNA之一。过去的研究发现miR-16-5p在非小细胞癌、肝癌、胃癌等肿瘤患者血清中均有显著变化。Fan等[8]的研究显示miR-16-5p诊断非小细胞肺癌的灵敏度为0.88，特异度为0.86；Qu等[9]发现miR-16-5p诊断肝癌的灵敏度为0.721，特异度为0.888；而在Wang等[10]的研究中，miR-16-5p诊断胃癌的灵敏度为0.79，特异度为0.78。上述研究表明，miR-16-5p或可作为某些特点肿瘤诊断的潜在生物标志物。近些年的研究已经证实miR-16-5p在食管鳞癌患者血清中表达上调[11-12]，这与本研究结论一致。

另一方面，大量研究发现miR-16-5p在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中起着重要作用[13-15]。Qu等[13]的研究显示miR-16-5p通过靶向血管内皮生长因子A抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡。同时，Cheng等[14]发现miR-16-5p可通过直接靶向胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）蛋白表达抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。在结直肠癌，Wu等[15]发现miR-16-5p通过血管内皮生长因子A/血管内皮生长因子受体1/蛋白激酶B（VEGFA/VEGFR1/Akt轴起抑癌作用。上述研究表明miR-16-5p是多种肿瘤发生和进展的关键因子。

综上所述，miR-16-5p在食管鳞癌患者血清和癌组织中均显著上调，或可作为食管鳞癌辅助诊断的生物标志物。miR-16-5p可能通过调控翻译、结合蛋白、细胞黏附从而影响食管鳞癌的发生、发展，多条肿瘤相关信号通路或参与该过程。