黑曲霉固体发酵黄芪工艺及其在蛋鸡上的应用研究

宋予震，史洪涛，范明夏，卢建洲，边传周，乔宏兴

(河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

中药作为饲料添加剂在畜牧业中的应用越来越广泛，但因细胞壁的阻碍导致部分有效成分不能被动物吸收利用。黑曲霉(Aspergillusniger)是一种产纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶等酶的真菌，纤维素酶能够分解植物细胞壁，充分释放营养物质，促进动物消化吸收[1]。张帅等[2]将16 g橘皮添加到黑曲霉固态发酵培养基中，接种量15%，发酵时间60 h，纤维素酶活力达1 816 U/g；胡伟等[3]采用正交试验研究黑曲霉固体发酵三七残渣产淀粉酶，结果显示淀粉酶活力约为84 U/g。利用黑曲霉对中药进行发酵能够提高中药药效，改善动物肠道健康，从而提高生产性能。Sun等[4]研究证明，用黑曲霉发酵银杏叶可改善蛋鸡的生长性能、蛋品质、脂质代谢和免疫力。黑曲霉在固体发酵研究中也存在一些问题，如理论研究上缺乏动力学支持导致生产上停留在经验化生产水平。此外，黑曲霉为需氧型真菌，在固体发酵过程中存在参数不易检测、无菌操作难以实现、过程不易控制、劳动强度大等问题。本研究通过对黑曲霉固体发酵黄芪产酶特性进行条件优化，并研究其在蛋鸡上的应用情况，旨在为新型酶制剂的开发提供数据参考，同时为黄芪的综合利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪饮片购于河南省禹州市中药材专业市场；黑曲霉菌(保藏编号3.316)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 黑曲霉固体发酵黄芪条件优化

1.2.1 菌种活化及麸曲种子制备 用接种环挑取黑曲霉菌种，接种到PDA斜面培养基(马铃薯200 g,葡萄糖20 g，琼脂15～20 g, 蒸馏水1 000 mL)上，于28 ℃霉菌培养箱中培养5～7 d。待孢子长满后，采用同样的方法将活化后的黑曲霉孢子接入麸曲培养基(市售麸皮:蒸馏水=2:1，拌匀后高压灭菌备用)，于28 ℃培养8～10 d，麸曲菌种接种前将黑曲霉孢子用无菌水稀释成1×108cfu/mL的孢子悬液备用。

1.2.2 黑曲霉发酵黄芪培养条件优化

1.2.2.1 接种量 以0.1%、0.5%、1%、3%、5%(W/W)的麸曲菌种接种量分别接种于含水量为35%(V/W)已灭菌的黄芪固体粉末中，28 ℃培养9 d。

1.2.2.2 时间 以1%(W/W)的麸曲菌种接种量接种于含水量为35%(V/W)已灭菌的黄芪固体粉末中，28 ℃分别培养0、3、6、9、12 d。

1.2.2.3 含水量 制备含水量为25%、30%、35%、40%、45%、50%(V/W)的黄芪固体粉末。以1%(W/W)的麸曲菌种接种量接种于已灭菌的不同含水量的黄芪固体粉末中，28 ℃培养9 d。

1.2.2.4 温度 以1%(W/W)的麸曲菌种接种量接种于含水量为35%(V/W)已灭菌的黄芪固体粉末中，20、24、28、32、37 ℃分别培养9 d。

1.2.2.5 正交试验优化 根据单因素试验结果及正交试验设计原则，选取温度(A)、接种量(B)、含水量(C)3个因素，通过3因素3水平(L9(34))进行正交试验，见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level

1.2.3 发酵过程 将黄芪粉培养基置于1 000 mL三角瓶中，瓶口覆盖过滤透气封口膜，高压灭菌后在无菌操作台中进行接种，然后置于霉菌培养箱中进行培养，培养过程中每天晃动培养基防止结块。

1.3 酶活力及黄芪多糖检测方法

1.3.1 黄芪固体发酵物纤维素酶活力测定 采用羧甲基纤维素酶法测定纤维素酶活力[5]，在一定条件下，将1 g固体样品每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖的微克数定义为1个酶活力单位，以固体样品所含的酶活力单位(U/g)表示。

1.3.2 黄芪固体发酵物淀粉酶活力测定 淀粉酶活力测定参考食品安全国家标准[6]。

1.3.3 黄芪固体发酵物黄芪多糖提取测定 多糖含量的测定用苯酚硫酸法[7]。

1.4 动物试验及试验日粮

试验采用单因子试验设计，选择280日龄海兰褐蛋鸡72只，由河南炎黄生物工程有限公司提供，随机分为4组，每组3个重复，每个重复6只鸡，预饲期3 d，试验期28 d。对照组饲喂基础日粮，黄芪组在对照组基础上添加0.2%的黄芪，黑曲霉组在对照组基础上添加0.2%的黑曲霉，发酵黄芪组在对照组基础上添加0.2%的黑曲霉发酵黄芪，发酵制剂于37 ℃干燥箱内烘干至恒重后添加到蛋鸡日粮中，孢子数≥1×108cfu/g，添加量以日粮的质量百分比计算。基础日粮参考NRC (1994)[8]蛋禽营养需要量配制, 详细配方组成和营养水平见表2。

表2 基础日粮组成和营养成分Table 2 Basic diet composition and nutritional composition

1.5 指标测定

1.5.1 生产性能测定 试验期间，每天以重复为单位记录产蛋数(截止每天21:00)、总蛋重，计算1～14 d、15～28 d的产蛋率和料蛋比。

1.5.2 血清抗氧化指标测定 试验第14、28天，每个重复随机选1只鸡进行心脏采血5 mL，37 ℃恒温培养箱静置分层，分离血清，-20 ℃冻存备用。用ELISA检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)检测血清中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)含量。

1.6 数据分析

试验数据采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，统计结果以“平均数±标准差”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。利用SPSS 24.0软件按3因子3水平(3×3)有重复程序对正交试验各项数据进行K值分析，确定最优组合。

2 结果与分析

2.1 淀粉酶活力检测结果

淀粉酶活力检测结果如图 1a所示。淀粉酶活力随黑曲霉接种量增加逐渐升高，在接种量为1%时酶活力达到最大值，为0.96 U/g(图1)；淀粉酶活力随黄芪含水量的升高逐渐升高，在含水量达45%时酶活力达到最大值0.99 U/g，之后逐渐下降(图1b)；淀粉酶活力随发酵温度升高逐渐升高，当温度达28 ℃时达到最大值0.95 U/g，之后缓慢下降(图1c)；随发酵时间的增加淀粉酶活力逐渐升高，第9天达到最大值，为0.93 U/g，之后逐渐下降并趋于稳定(图1d)。

图1 不同发酵条件对淀粉酶活力的影响Fig.1 Effect of different fermentation conditions on amylase activity

2.2 纤维素酶活力检测结果

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 利用DNS法[9]进行还原糖含量的测定，并以葡萄糖标准品浓度为横坐标，540 nm条件下的吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，可得葡萄糖的浓度和吸光度的关系。回归方程为Y=1.3511x-0.0676、R2=0.9997，葡萄糖浓度在0.1～0.7 mg/mL 间具有良好的线性关系(图2)。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 The standard curve of glucose

2.2.2 不同发酵条件对纤维素酶活力的影响 纤维素酶变化规律如图3所示。纤维素酶活力随接种量的增加逐渐升高，在接种量为1%时达到最大值51.33 U/g，之后逐渐下降(图3a)；纤维素酶活力随黄芪含水量升高缓慢升高，当接种量达45%时达到最大值71.00 U/g，之后趋于下降(图3b)；随发酵温度升高纤维素酶活力呈现先升高后下降再逐渐升高的趋势，当温度达到37 ℃时酶活力最高为73.33 U/g(图3c)；纤维素酶活力随着发酵时间增加逐渐升高，在第9天达到最大值60.67 U/g，之后趋于稳定(图3d)。

图3 不同发酵条件对纤维素酶活力的影响Fig.3 Effect of different fermentation conditions on cellulase activity

2.3 多糖含量检测结果

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 根据苯酚硫酸法[10]进行多糖含量的测定，并以葡萄糖标准品浓度为横坐标，490 nm吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，可得葡萄糖浓度与吸光度的关系。回归方程为Y=13.076x-0.0004、R2=0.9996，葡萄糖浓度在0～0.5 mg/mL 间具有良好的线性关系(图4)。

图4 葡萄糖标准曲线Fig.4 The standard curve of glucose

2.3.2 不同发酵条件对多糖得率的影响 黄芪多糖得率测定结果如图5所示。随接种量增加多糖得率呈现先降低后升高的趋势，在接种量为1 %时多糖得率最低，为4.12%(图5a)；多糖得率随黄芪含水量升高逐渐降低，当接种量为40%时多糖得率最低，为3.10%，之后随含水量增加缓慢上升(图5b)；多糖得率随发酵温度升高而降低，当温度达到28 ℃时多糖得率最低，为4.62%，之后逐渐趋于稳定(图5c)；多糖得率随发酵时间延长呈现先降低再升高的趋势，第9天最低，为4.57%(图5d)。

图5 不同发酵条件对多糖得率的影响Fig.5 Effect of different fermentation conditions on polysaccharide yield

2.4 正交工艺优化

通过正交试验优化发酵过程中的温度、接种量、含水量等条件对纤维素酶活力的影响，结果如表3显示，通过R值选择各因素对纤维素酶活力的影响效果为温度>接种量>含水量，考虑到黑曲霉发酵黄芪中纤维素酶活力指标的重要性，确定其最佳工艺为A3B2C2，即温度37 ℃，接种量1%，含水量45%时为最佳发酵条件。通过试验验证，在该条件下，纤维素酶活力可达82.26 U/g。

表3 纤维素酶活力正交试验直观分析表Table 3 Visual analysis of orthogonal test for cellulase activity

2.5 蛋鸡的生产性能及血清抗氧化指标

2.5.1 不同处理对蛋鸡生产性能的影响 如表4所示，1～14 d各组间的产蛋率和料蛋比差异不显著(P>0.05);15～28 d发酵黄芪组产蛋率最高，与对照组、黄芪组、黑曲霉组相比分别提高了18.79%、9.21%、12.85%，差异显著(P<0.05);黄芪组与对照组相比提高了8.77%，差异显著(P<0.05)。同时，发酵黄芪组料蛋比最低，与对照组、黄芪组、黑曲霉组相比分别降低了19.71%、9.49%、20.62%，差异显著(P<0.05);黄芪组与对照组、黑曲霉组相比分别降低了9.33%、10.17%，差异显著(P<0.05)。

表4 不同处理对蛋鸡产蛋性能的影响Table 4 Effect of different treatments on laying performance of laying hens

2.5.2 不同处理对蛋鸡抗氧化指标的影响 如表5所示。在第14 d，发酵黄芪组CAT 活性最高，与黄芪组差异显著(P<0.05)；发酵黄芪组MDA含量最低，与对照组和黑曲霉组相比差异显著(P<0.05)，但与黄芪组相比差异不显著(P>0.05)；发酵黄芪组T-AOC活性高于其他组，差异显著(P<0.05)。在第28天，发酵黄芪组CAT、GSH-Px、SOD活性均高于其他组且差异显著(P<0.05)。

表5 不同处理14 d和28 d对蛋鸡抗氧化指标的影响Table 5 Effect of different treatments on the quality of eggs for 14 days and 28 days

3 讨 论

3.1 不同发酵条件对黑曲霉产酶活力的影响

王晓娇[11]研究发现含水量、接种量、发酵温度、发酵时间等是影响固体发酵的重要因素。本研究利用这4个条件对黑曲霉固体发酵黄芪产纤维素酶和淀粉酶进行了单因素优化试验。结果表明：接种量较低时，培养基中的营养成分没有被充分利用，产酶量较低；接种量过大时黑曲霉生长迅速，黄芪中营养成分供应不足，菌体快速生长导致溶氧不足，产生大量热，使培养基温度过高，从而对菌丝生长和酶活力都有影响，这与张家庆等[12]的研究一致。在固体发酵中，含水量是制约菌体生长和产酶的关键因素。含水量过低，一方面无法满足菌体正常的生长代谢，另一方面影响黄芪粉末颗粒的吸水膨胀，阻碍其中营养成分的溶解与传递，导致产酶量下降；含水量过高，黄芪颗粒易结成块状物，降低培养基透气性，阻碍氧气的输送及热量的扩散，不利于菌体的生长和孢子的产生，从而影响产酶量。在优化发酵时间方面，发酵时间较短时，黑曲霉菌体处于生长调整期，随着发酵时间的延长，产酶量逐渐增多，之后趋于平稳，达到产酶稳定期。在优化发酵温度方面，在一定温度范围内，温度升高会加快黑曲霉的生长代谢，产酶量增加；当温度过高时，黑曲霉机体内的某些核酸、蛋白质遭到破环，菌体易衰老，同时还会影响培养基的物理性质和溶氧，从而间接影响酶的合成[13]。因此在发酵过程中，含水量、接种量、发酵时间和温度等条件对菌体生长和产酶极其关键，控制好条件是发酵过程的重要环节。本研究在单因素条件优化的基础上，通过正交试验确定了黑曲霉固体发酵黄芪产纤维素酶的最佳优化条件为温度37 ℃、接种量1%、含水量45%、发酵时间9 d。这为后期研究及工艺生产应用提供了一定的理论依据。

3.2 不同发酵条件对多糖得率的影响

黄芪多糖作为黄芪重要的活性物质，在许多情况下是机体贮存能量和结构支撑的主要物质，在机体代谢过程中被修饰转化，发挥着提供能量和营养物质的功能。本研究结果表明，在黑曲霉固体发酵黄芪过程中优化接种量、含水量、发酵时间、温度等因素条件下，多糖得率呈现先降低后上升的趋势，随温度变化多糖得率先降低后趋于平稳，这与刘超等[14]的研究不完全一致。分析原因，一可能是由于本试验所用的发酵培养基没有添加额外的营养成分，而在菌体发酵过程中碳源对于黑曲霉的生长代谢具有重要影响[15]，而多糖作为黄芪中重要的碳水化合物，在发酵过程中很可能被菌体消耗利用，并进行自我繁殖；二是本研究采用固体发酵，与液体发酵有所区别。目前有关黑曲霉固体发酵黄芪的研究报道甚少，黄芪经黑曲霉菌发酵后多糖、黄酮、皂苷等活性成分的变化规律尚不明确。此外，黄芪粒径、pH等条件对发酵过程有何影响等都需要未来进一步的研究和探讨。

3.3 发酵黄芪对蛋鸡生产性能的影响

黄芪作为传统的补益类中药，具有增强机体免疫力、降血糖、抗肿瘤和延缓衰老等功效[16]。因鸡体内缺乏内源性纤维素酶，在黄芪的利用过程中由于细胞壁的存在严重阻碍其活性成分的释放[17]，同时日粮中占相当比例的纤维营养成分不能有效被利用。黄芪经黑曲霉发酵后，产生的纤维素酶能有效降解黄芪细胞壁，使活性成分得以充分释放，从而提高药效，同时纤维素酶能促进日粮饲料中纤维素和半纤维素降解成更多的葡萄糖及挥发性脂肪酸，产生独特的香甜味，提高饲料的适口性，促进纤维营养成分的消化与吸收，进而提高蛋鸡采食量[18-19]。本试验在蛋鸡基础日粮中添加0.2%发黑曲霉发酵黄芪制剂，显著提高了15～28 d的蛋鸡产蛋率，同时料蛋比显著降低。有研究人员报道，在基础日粮中添加一定量的发酵黄芪能明显促进动物生长，提高生产性能[20-21]。李岑曦等[22]研究表明添加纤维素酶可在一定程度上增加肉鸡日增重，提高肉鸡饲料转化率。李文斌等[23]研究表明饲料中添加复合纤维素酶，提高蛋鸡的产蛋率和蛋重，降低料蛋比。这些研究结果与本试验结果一致。

3.4 发酵黄芪对蛋鸡抗氧化指标的影响

动物机体的抗氧化酶主要包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等，他们在平衡动物机体氧化和抗氧化方面发挥着至关重要的作用。本研究发现，黑曲霉发酵黄芪制剂能提高不同饲喂阶段蛋鸡的血清抗氧化水平。分析原因，可能是由于黄芪中甲苷、黄酮类等活性成分增加[24-25]，而且黄芪发酵后会产生其他具有抗氧化作用的成分。阮鸣等[26]研究表明，黄芪甲苷在发酵过程中转化生成6-O-B-D-葡萄糖基-环黄芪醇，其具有显著的抗氧化及增强药效的作用。夏素银等[27]研究发现苜蓿草粉和纤维素酶能显著提高蛋鸡的SOD活性，降低MDA含量。值得注意的是，第28天各组的MDA含量均有所升高，但差异不显著，这可能与试验周期延长、氨浓度的积累有关。有研究报道称不同氨气浓度能刺激动物机体相关的免疫基因下调，从而诱导机体出现氧化应激和损伤等[28-29]。

4 结 论

本研究通过对黑曲霉发酵黄芪过程中酶活力和多糖得率进行单因素优化，初步确定淀粉酶最优发酵条件为温度28 ℃，接种量1%，含水量45%，发酵时间9 d；纤维素酶最优发酵条件为温度37 ℃，接种量1%，含水量45% ，发酵时间9 d。在单因素试验基础上通过正交试验确定黄芪固体发酵产纤维素酶的条件在温度为37 ℃，接种量为1%，含水量为45%时纤维素酶活力达到最高。本试验以纤维素酶活力为指标对黑曲霉发酵黄芪工艺进行条优化后，在蛋鸡基础日粮中添加0.2%的发酵黄芪制剂，能显著提高蛋鸡的产蛋率，降低料蛋比，同时提高血清抗氧化能力。综上所述，黑曲霉发酵黄芪有望成为一种新型绿色的促生长饲料添加剂应用到动物生产中。