布鲁氏菌BP26抗体iELISA检测方法建立

吕素芳 ，胡莉萍 ，董炳梅 ，任洪林，莫 玲，李 峰*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2.山东省动物疫病预防与控制中心，山东 济南250022；3.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州256600；4.吉林大学 人兽共患病研究所，吉林 长春130062)

布鲁氏菌病(brucellosis)又称地中海弛张热、马耳他热，是由布鲁氏菌(Brucellasp.)引起的一种以流产和发热为特征的人畜共患性传染病，主要宿主有猪、牛、羊、狗等动物和人，传播途径主要是经消化道、呼吸道和皮肤粘膜传染。人可通过直接接触患病动物、从事畜产品加工或食用感染食物等途径感染，严重威胁着人和动物的生命健康。布鲁氏菌病呈世界范围性流行，可致多种家畜感染，继而引发流产、不育以及人的波浪热，对全球畜牧业造成严重的经济损失，已成为潜在危害人类健康和公共卫生的重要病原之一[1-2]。中国将该病列为二类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类流行病。中国流行的主要是羊(Br.melitensis)、牛(Br.bovis)、猪(Br.suis)3种布鲁氏菌，其中以羊布鲁氏菌病最为多见，其次是牛种布鲁氏菌。近几年来随着畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病在多数疫区有明显回升的趋势。由于该病的治疗非常困难，对临床检测阳性的动物多采取淘汰处理，因此日常的防控与监测工作尤为重要。

布鲁氏菌细胞膜是3层膜结构，由内到外依次为细胞质膜、外周胞质膜和外膜，细胞膜中含有多种外膜蛋白(OMPs)。目前，国内外科研人员已经发现了许多针对布鲁氏菌的免疫原性蛋白，可用作诊断和亚单位疫苗制备候选蛋白。其中外膜蛋白已经证明在实验室条件下具有良好的免疫活性和保护作用，如OMP10、OMP16、OMP25、OMP31、OMP2b、OMP28(BP26)和L7/L12[3-4]。OMP28又称 BP26，存在于所有布鲁氏菌菌株中，能引起保护性免疫反应，且在羊、牛、狗和人中均具有很高的免疫原性，可作为未来亚单位疫苗的候选蛋白之一[5-6]。ElTahir等[7]通过抗BP26小鼠血清的研究，鉴定出BP26蛋白具有5个线性表位，其中C末端的肽结合最强。本研究以克隆、原核表达获得的OMP28(BP26)蛋白为抗原，建立了针对BP26抗体的iELISA检测方法，并在牛和羊血清样品中初步应用，以期提高血清抗体检测的准确率。

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 感受态细胞DH5α、BL21(DE3)表达菌、原核表达载体pET-28a由山东省滨州畜牧兽医研究院重点实验室自制保存，猪种布鲁氏菌S2株(Brucellasuis)由中国兽医药品监察所提供。

1.1.2 主要试剂NdeⅠ、EcoRⅠ、pMD18-T载体、2×rTaq Mix、T4 Ligation kit、DL2000 Marker购自大连宝日医生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒和预染蛋白Marker 26616购自Fermentas,30%丙烯酰胺、过硫酸铵(APS)、SDS、TEMED、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、考马斯亮蓝快速染色液、乳清蛋白、猪血清、Triton-100、蛋白酶抑制剂等购自山东思科捷科学仪器有限公司；琼脂糖、Tween-20、IPTG等购自Sigma公司；His-镍离子亲和层析柱购自GE生命科学；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和TMB购自北京天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；HRP标记兔抗反刍动物二抗购自河南洛阳佰奥通实验材料中心；羊和牛布鲁氏菌病标准阳性与阴性血清、布鲁氏菌虎红平板凝集抗原购自中国兽医药品监察所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 基因设计 根据GenBank网站公布布鲁氏菌BP26蛋白的基因序列进行信号肽和抗原表位预测分析，去掉BP26蛋白基因前端信号肽序列，保留抗原表位序列，扩增约680 bp目的基因片段。上下游分别引入NdeI、EcoRI酶切位点，插入pET28a原核表达载体。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。BP26蛋白基因的上下游引物序列如下(划线部分为引入双酶切位点)：

BP26-1：5＇-CATATGGAGAATCAGATGAC GACGCAGC-3＇

BP26-2：5＇-GAATTCTTACTTGATTTCAAA AACGA-3＇

1.2.2 目的基因扩增 将布鲁氏菌S2菌株80 ℃水浴30 min以上进行灭活，应用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组作为PCR扩增模板。PCR反应体系为：2×rTaq mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL(浓度均为10 mmol/L)，模板DNA 10 μL，ddH2O 补足至50 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min终止反应。琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段为680 bp。

1.2.3 重组原核表达载体构建 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶回收，用NdeⅠ与EcoRⅠ分别对目的基因和pET-28a质粒进行双酶切并回收纯化，并将目的基因克隆至pET-28a载体上，经双酶切鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。经鉴定构建成功的重组原核表达载体命名为pET28a-BP26。

1.2.4 重组原核表达载体的诱导表达及条件优化 取构建成功的原核表达载体，转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基，37 ℃震荡培养12 h。获得的菌液经测序鉴定为阳性后，作为原始母液进行诱导表达。母液按照1∶50比例接种新鲜含卡那霉素的液体LB培养基，37 ℃震荡诱导培养2～3 h。按0.5、1和1.5 mmol/L比例分别加入IPTG诱导剂，在2、4、6、8 h分别取样，诱导温度为25 ℃和37 ℃，进行最佳表达条件摸索。

1.2.5 BP26蛋白的可溶性分析及纯化鉴定 利用摸索好的条件，对蛋白进行扩大培养、诱导表达。对培养物进行处理后超声波破碎裂解，进行SDS-PAGE电泳，分析其可溶性。沉淀用1/10体积的8 mol/L尿素溶解，保存待纯化。

含有蛋白溶液的菌体破碎液利用AKATA蛋白纯化系统，经过His-镍离子亲和层析纯化柱(5 mL×3)进行亲和层析纯化，所有缓存溶液均含8 mol/L尿素并进行0.22 μm孔径的滤膜抽滤排气除杂。具体纯化步骤参照说明书。洗杂和洗脱步骤中分别收集峰值处流出的液体，进行SDS-PAGE检测。对亲和层析后的蛋白溶液进行透析除尿素。取透析后的蛋白液进行SDS-PAGE检测及含量测定。

1.2.6 BP26蛋白Western blot分析 应用羊和牛布鲁氏菌病标准阳性血清为抗体，BP26纯化蛋白经SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜上，分别进行Western blot，确定纯化蛋白的抗原性和特异性，将纯化并鉴定正确的BP26蛋白分别冻干保存。

1.2.7 BP26抗体iELISA检测方法建立与优化

1.2.7.1 BP26蛋白抗原与血清最佳稀释度的确定 采用方阵法，利用纯化后的BP26蛋白作为包被抗原，设置1:25、1：50、1：100、1：200、1：400几个稀释度，分别用包被缓冲液稀释后包被ELISA板，每孔100 μL，选择3个包被条件(4 ℃过夜、37 ℃ 1 h和37 ℃ 2 h)进行优化；羊和牛布鲁氏菌病标准阳性血清和阴性血清分别按照1:25、1：50、1：100、1：200、1：400几个稀释度，每孔100 μL,37 ℃孵育1 h。其余步骤采用常规方法，测定OD450值，计算相应阳性血清孔OD450值与阴性血清孔OD450值的比值，即P/N值。选取P/N值最大孔所对应的抗原包被浓度和阴、阳性血清稀释倍数为最佳条件，最终确定抗原与血清最佳稀释度。

1.2.7.2 封闭条件的确定 封闭液分别选择乳清蛋白和猪血清，封闭条件为4 ℃过夜、37 ℃ 1 h和37 ℃ 2 h进行筛选，用阴、阳性血清检测OD450值，选取P/N值最大孔所对应的一组条件为最佳封闭条件。

1.2.7.3 二抗稀释度与TMB底物作用条件的确定 酶标二抗稀释度分别选择1/2000，1/4000和1/8000，其他条件选择优化后的最佳条件进行，选取P/N值最大孔所对应的一组条件为最佳二抗稀释度。底物显色条件分别选择室温15 min，37 ℃ 15 min 和室温30 min进行优化，其他条件选择优化后的最佳条件进行，选取P/N值最大孔所对应的一组条件为最佳底物作用条件。

1.2.7.4 阴阳性临界值的确定 选取经虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测均阴性的羊布鲁氏菌抗体阴性血清样品110份和牛布鲁氏菌抗体阴性血清样品180份，按照上述优化后的ELISA检测条件进行检测，最终确定临界值。临界值=3×标准差+阴性血清OD450均值。

1.2.7.5 iELISA特异性试验 应用建立的羊布鲁氏菌病血清抗体iELISA检测方法，分别对耶尔森菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、羊布鲁氏菌病阳性血清和牛布鲁氏菌病阳性血清进行检测，确定其特异性。

1.2.7.6 与虎红平板凝集试验符合率分析 应用布鲁氏菌虎红平板凝集试验检测采集自山东省不同地区的规模羊场的413份血清样品和规模化牛场的186份血清样品。413份羊血清样品中阳性血清28份，阴性血清385份；186份牛血清样品中阳性血清29份，阴性血清157份。应用本研究建立的BP26抗体iELISA检测方法进行检测，计算两者的符合率。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增

利用设计的一对引物进行PCR扩增，电泳检测成功获得了约680 bp大小的目的基因片段(图1)。

图1 目的基因PCR扩增M. Marker DL2000；1. BP26基因Fig.1 PRC exemplification of target geneM. Marker DL2000；1. BP26 gene

2.2 重组原核表达载体的构建

将构建的原核表达载体pET28a-BP26进行NdeⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定，可见约680 bp与5.4 kb大小的DNA片段和载体片段，与预期结果一致(图2)。测序结果经Blast分析，与GenBank公布的目的基因序列100%相同。说明重组原核表达载体pET28a-BP26构建成功。

图2 重组原核表达载体双酶切鉴定1. pET28a-BP26载体双酶切结果；M. Marker DL2000Fig. 2 Double enzyme digestion identification ofrecombinant prokaryotic expression vector 1. Double enzyme digestion identification of pET28a-BP26vector；M. Marker DL2000

2.3 目的蛋白的表达与可溶性分析

在BL21(DE3)表达菌中将重组原核表达载体pET28a-BP26进行诱导表达，经SDS-PAGE显示，在约28 kU位置出现目的蛋白条带(图3)，与预期大小一致，而对照组没有出现相应目的条带。说明重组原核表达载体诱导表达成功。表达后菌液破碎处理后取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果表明BP26蛋白是以包涵体形式大量存在于沉淀中(图4)。优化后的蛋白最佳表达条件为：加入IPTG诱导剂浓度为1 mmol/L，37 ℃震荡培养，诱导表达4 h后收集菌液即可。

图3 重组载体pET28a-BP26表达的SDS-PAGE1，4. 菌液诱导表达后；2，3. 菌液诱导表达前；M. 蛋白Marker 26616Fig. 3 SDS-PAGE of recombinant vector pET28a-BP261，4. after induction of bacterial expression；2，3. beforeinduction of bacterial expression；M. protein Marker 26616

图4 目的蛋白可溶性分析1. 超声波破碎后上清；2. 超声波破碎后沉淀；M. 蛋白MarkerFig. 4 Target protein solubility analysis1. Supernatant after sonication；2. Precipitation afterultrasonic breaking；M. protein Marker

2.4 目的蛋白的纯化与Western blot分析

采用His-镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳获得1条28 kU大小的目的条带，表明BP26蛋白纯化成功(图5)。经测定，纯化后的BP26蛋白为680 μg/mL。将纯化的BP26蛋白分别与牛和羊标准阳性血清进行Western blot分析，均检测出了同样大小的条带，与SDS-PAGE检测到的条带相符。结果表明，BP26蛋白能与牛和羊的布鲁氏菌阳性血清发生反应，具有良好的免疫学活性，可作为牛羊血清抗体检测的通用抗原(图6)。

图5 BP26蛋白纯化M. 蛋白Marker 26616；1. BP26蛋白柱纯化后 Fig. 5 BP26 protein purificationM. protein Marker 26616；1. BP26 proteincolumn after purified

图6 BP26蛋白Western blotM. 蛋白Marker 26616；1. 空白对照；2. 羊阳性血清；3. 牛阳性血清Fig.6 BP26 protein Western blotM. protein Marker 26616； 1. blank control；2. positive serum of sheep； 3. positive serum of cattle

2.5 BP26抗体iELISA检测方法的建立

2.5.1 iELISA检测方法条件优化 通过方阵试验，确定了BP26蛋白抗原对牛和羊血清的最佳包被浓度均为13.6 μg/mL，即1：50倍稀释度。血清抗体最佳稀释度为1：100。经过对其他条件筛选，发现牛羊用布鲁氏菌病血清抗体iELISA检测方法最佳条件是：1.5%猪血清封闭，37 ℃1 h，二抗稀释度为1：2000，37 ℃显色15 min。

2.5.3 iELISA检测方法的特异性试验 应用以上建立的iELISA检测方法分别对耶尔森菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、牛布鲁氏菌和羊布鲁氏菌的阳性血清进行检测。结果显示，牛布鲁氏菌阳性血清的OD450为0.384，羊布鲁氏菌阳性血清的OD450为0.647，均为阳性。而其他菌的阳性血清均为阴性。说明该iELISA方法具有较好的特异性。

2.5.4 与布鲁氏菌虎红平板凝集试验对比性试验 对采集自山东省不同地区的规模羊场的413份血清样品和规模化牛场的186份血清样品应用布鲁氏菌虎红平板凝集试验和iELISA检测，结果见表1。本研究建立的iELISA检测方法相对于传统的虎红平板凝集试验，羊血清和牛血清符合率都在90%以上，特异性高。

表1 羊、牛布鲁氏菌病BP26抗体iELISA与虎红平板凝集试验对比Table 1 Comparison of iELISA detection method for sheep and cattle brucellosis BP26 antibody and tiger red plate agglutination test

3 讨 论

布鲁氏菌病是一种全球性疾病，流行于全球170个国家和地区，据统计每年约50×104人新感染。人感染后治疗周期长，疗效不理想，该病是严重危害人类健康的疫病之一。由于人类主要是经患病动物或受污染的畜产品感染，所以如何控制并净化家畜的布鲁氏菌病成为畜牧业生产急需解决的问题。中国2012年发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》[8]，2014年发布《牛羊常见疫病防控技术指导意见》[9]，均将布鲁氏菌病列为主要防控对象。

目前布鲁氏菌病的实验室检测方法主要包括病原学和血清免疫学，其中病原学方面包括各类PCR方法、单核苷酸多态性检测、脉冲场凝胶电泳技术、荧光偏振试验等，免疫学方法包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、变态反应、ELISA检测方法等[10-11]。病原学方法由于细菌培养比较复杂、时间比较长，使用最先进的自动血液培养系统培养布鲁氏菌仍需5～7 d[12]，而且对实验室生物安全级别要求较高，不适合临床大规模操作,目前临床检测仍以血清学为主。ELISA方法具有敏感性和特异性强、操作简单快速、重复性好等特点，可同时完成大量样品的检测，是当前动物流行病学调查和临床免疫监测广泛采用的血清学诊断技术[13]。Zhang等[14]通过收集不同国家和地区有关布鲁氏菌病控制或根除计划的资料，发现无论是单独还是联合，疫苗接种、检测和屠宰计划都能有效降低布鲁氏菌病的流行率。本研究克隆、表达、纯化了布鲁氏菌外膜蛋白BP26，并作为包被抗原建立优化了布鲁氏菌抗体iELISA检测方法，对临床采集的牛和羊血清样品进行了初步应用。结果表明，建立的iELISA检测方法具有良好的特异性和敏感性，与虎红平板凝集试验结果相比，敏感性85%以上，特异性95%以上，符合率90%以上，与Chaudhuri等[15]的研究结果一致，且可同时进行大量样品操作，适用于临床对牛羊布鲁氏菌病抗体进行大规模初筛。

造成敏感性差异较大的原因主要是诊断原理不同，虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌全菌的凝集反应抗体水平，ELISA检测布鲁氏菌部分抗原的抗体反应水平。经组装成牛羊用布鲁氏菌病抗体iELISA检测试剂盒，先后对采自山东滨城区、惠民县、经济技术开发区、博兴县等地区的近30家近500份牛/羊血清进行了初步检测，大体摸清了周边地区多个规模化牛羊场布鲁氏菌病血清学抗体水平情况，为开展区域布鲁氏菌病基线调查发挥了重要作用。

4 结 论

本研究建立的iELISA检测方法具有良好的特异性和敏感性，与虎红平板凝集试验结果相比，敏感性85%以上，特异性95%以上，符合率90%以上，适用于临床对牛羊布鲁氏菌病抗体进行大规模初筛，为布鲁氏菌病抗体监测及净化提供技术支持。