大鲵皮肤水溶性蛋白质成分分析及活性鉴定

宋为嘉，杨 辉，王 慧，陈永庆，耿 硕，熊冬梅，杨 菁，李忠虎，王立新*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225007；3.三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，中国三峡长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，湖北 宜昌 443100；4.陕西华鲵生物科技有限公司，陕西 城固723200)

大鲵(Andriasdavidianus)是中国特有的两栖类动物，属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科。大鲵体长可达1.5 m，最大体重可超过50 kg，是世界上现存最大的两栖类[1]。由于环境污染和过度捕捞，致使野生大鲵数量急剧下降, 被列为国家二级保护动物, 并列入濒临绝种野生动植物国际贸易公约(CITES) 附录 Ⅰ 中[2]。大鲵具有极高的食用价值，其肌肉富含水分，肉质鲜美，肌肉中总氨基酸含量18.64%，并且其中含有大量必需氨基酸，符合人体需求[3]。从大鲵肌肉提取出的大鲵油中含有2种多不饱和脂肪酸，具有抗氧化活性，能够提高机体免疫力，对人体具有保健功能[4]。大鲵作为药材具有悠久的历史，其药用价值在《本草纲目》早有记载。大鲵身体多个部分均可入药，包括皮肤及其分泌的黏液。中医认为，大鲵具有生血、明目等功效；现代医学认为，食用大鲵可以清除体内自由基、减少对机体造成损伤，还能够促进人体抗癌因子的产生，提高免疫力从而降低癌症发生几率[5]。

大鲵皮肤具有辅助呼吸、调节水分、抵御捕食者、抵抗微生物入侵、排泄、生殖等功能，是保护大鲵免受伤害、适应生存环境的重要器官。大鲵皮肤上的黏液主要由2种腺体分泌。一种是黏液腺，可分泌粘糖蛋白，这是大鲵皮肤黏液主要成分。黏液覆盖在皮肤表面，形成一层天然的护盾，维持皮肤水平衡，从而保护皮肤不受外界环境伤害[6]。另一种是颗粒腺，能够分泌出药理活性物质，抵御微生物和捕食者[7]，被称作“毒腺”。皮肤黏液有多种作用。有研究表明，腹腔注射大鲵皮肤分泌物能够使小鼠死亡，低剂量注射黏液到小鼠皮肤也能够导致水肿和疼痛，说明大鲵皮肤分泌物具有复杂的毒性作用[8]。此外，大鲵皮肤黏液具有抗氧化[9]、促进伤口愈合[10]、保护肝脏免受酒精[11]以及四氯化碳[12]等物质的损伤以及抗菌[13]、抑制癌症[14]等功能。此外，大鲵皮肤具有抗氧化、促进伤口愈合、保护肝脏免受酒精和四氯化碳等物质损伤、抗菌、抑制癌症等功能。

1 材料与方法

1.1 材料

供试大鲵购自陕西省留坝县，所有样本均为人工养殖的大鲵第二代。体重为508.4±10.5 g。试验大鲵在室内水箱中暂养，水箱内水面略低于大鲵背部，以保证大鲵可顺利浮出水面呼吸；水箱内放少量泥鳅供大鲵自由采食；试验期间定期换水，保持大鲵生存水质良好。在采集皮肤黏液样品期间大鲵身体状态良好，体质健康，无任何异样。

1.2 黏液的采集

轻轻取出大鲵置于操作台上，待大鲵稳定下来，用沾湿毛巾或纱布盖住大鲵头部。用消毒针管吸75%酒精1 mL，轻轻喷洒于大鲵背部，喷洒2～3次，待大鲵背部皮肤产生白色分泌物并发出刺激性气味时，用消毒的移液枪头轻轻刮取分泌物，然后将枪头与分泌物一同放到15 mL离心管中，收集的分泌物用灭菌水进行溶解，充分混匀。在4 ℃条件下，12 000 r/min离心15 min，收集上清，保存于-20 ℃。同一只大鲵不宜连续多次收集分泌物，以防造成损伤。

1.3 黏液样品水溶性蛋白质含量测定

配置1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液，用PBS稀释至 0、20、40、60、80、100、120 μg/mL。添加5倍体积的考马斯亮蓝蛋白显色液混合，室温静置5 min，检测595 nm波长处吸光值，重复测量3次，取平均值，建立标准曲线和回归方程，计算样品浓度。

1.4 细菌凝集反应

采用大肠杆菌(E.coli)和嗜水气单胞菌(A.hydrophlia)检测大鲵皮肤黏液蛋白细菌凝集活性。37 ℃条件下培养大肠杆菌、嗜水气单胞菌至对数生长期。6 000 r/min离心保留沉淀，使用无菌PBS稀释细菌至3×107CFU/mL。将细菌与终浓度为150 μg/mL的样品混合均匀涂布到无抗固体培养基中。对照组添加等体积PBS缓冲液。培养6 h后使用光学显微镜观察细菌凝集情况。

1.5 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质样品抗氧化活性检测

1.5.1 DPPH清除能力检测 将1 mL浓度为1 mmol/L的DPPH与不同浓度的样品混合，加入蒸馏水定容至5 mL，使样品终浓度分别为10、50、100、200和400 μg/mL。在室温下静置30 min后，测定其在515 nm下的吸光值。添加等体积的PBS作为对照组。并使用公式(1-试验组/对照组)×100%计算DPPH清除率。

1.5.2 ABTS清除能力检测 准确称取0.384 g ABTS与0.134 g过硫酸钾于试管中，加入蒸馏水,定容至100 mL。轻轻摇晃混匀，在避光处放置过夜。取10 mL该溶液，用分光光度计测量其在734 nm下的吸光值，加入蒸馏水进行稀释，将其稀释为吸光值为0.7左右的溶液，记为A。取0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL浓度为400μg/mL的大鲵皮肤分泌蛋白溶液样品，加入3 mL溶液A，加入蒸馏水定容至10 mL。室温静置15 min后，用分光光度计测定在734 nm下的吸光值。添加等体积PBS作为对照组。大鲵皮肤黏液蛋白对ABTS的清除率计算方式为(1-试验组/对照组)×100%。

1.5.3 NO清除能力检测 准确称取0.2980 g SNP溶于纯水中并定容至10 mL。量取1 mL SNP溶液，分别加入0.5、1、2、4 mL浓度为400 μg/mL的大鲵皮肤黏液蛋白样品溶液，加入蒸馏水定容至5 mL，在25 ℃水浴锅中保温2.5 h，取出后立即加入等体积的Griess试剂，在540 nm下测定吸光值。添加等体积的PBS作为对照组。最终计算的清除率=[(A-B) /C-1]×100%。其中，A为SNP与样品共存时的吸光值，B为样品在540 nm下的吸光度，C为SNP在540 nm下的吸光值。

1.6 蛋白质谱分析

将大鲵黏液水溶性蛋白质样品送至北京邦菲科技有限公司进行质谱鉴定。使用Gene Ontology(GO)数据库对基因的分子功能(Molecular Function, MF)、以及参与的生物过程(Biological Process, BP)进行鉴定和分析。随后使用KEGG PATHWAY数据库进行分析确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳结果

电泳结果显示大鲵皮肤黏液样品中含有多种蛋白质，样品在14～100 kDa分子量范围内得到一定的分离，其中在50 kDa分子量以上蛋白条带较为丰富，100 kDa分子量以上有可见的较高丰度的蛋白条带，小于14 kDa的蛋白质含量较低(图1)。

图1 大鲵皮肤黏液样品SDS-PAGE电泳结果M. Blue Plus Protein Marker(14 kDa-100 kDa);1. 大鲵皮肤黏液样品Fig. 1 SDS-PAGE results of skin mucus samplesfrom Chinese giant salamanderM. Blue Plus Protein Marker(14 kDa-100 kDa);1. skin mucus samples of Chinese giant salamander

2.2 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质样品活性检测

2.2.1 细菌凝集试验结果 试验结果表明，与对照组相比，大肠杆菌和嗜水气单胞菌在大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质作用下发生明显的凝集反应(图2)，表明大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质对大肠杆菌及嗜水气单胞菌具有抑制作用。

图2 细菌凝集试验结果Fig.2 Results of bacterial agglutination experiment between samples and control group

2.2.2 对NO、DPPH和ABTS清除结果 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质对NO、DPPH和ABTS清除结果见图3。大鲵皮肤黏液蛋白质对DPPH与ABTS具有较强的清除能力，且清除率随大鲵皮肤黏液蛋白质的浓度升高显著升高，到浓度增加到200 μg/mL后，清除率升高趋于平缓，到400 μg/mL其清除率已经接近100%；样品对NO也有一定的清除能力，但效果并不理想，当蛋白质浓度为400 μg/mL时清除率接近40%，并且浓度进一步升高清除率却没有显著变化。

图3 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质对NO、DPPH、ABTS的清除效果Fig. 3 The NO, DPPH and ABTS scavenging activity

2.3 蛋白质谱结果

大鲵皮肤黏液水溶性蛋白质经Q-Exacitve HF质谱仪分析，共鉴定出66种蛋白质，其中分子量最大的是蜷曲受体-8相关多区域蛋白(Frizzled-8)，达277.5 kDa，分子量最小的是动力蛋白轻链(Dynein light chain)，分子量仅10.3 kDa(表1)。以上蛋白经GO功能鉴定，共发现20种免疫相关蛋白，包括热休克蛋白70、硒结合蛋白、泛素、钙调蛋白、泛素结合酶、钙结合蛋白、小泛素化改性剂、Rab(Ras-like in rat barin)蛋白、泛素结合酶E2、泛素碳末端水解酶、ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)、金属蛋白酶抑制剂2、NEDD8-泛素缀合酶、GTP(三磷酸鸟苷)-结合蛋白、泛素缀合酶、白介素增强子结合因子、蜷曲受体-8相关多区域蛋白 Frizzled-8、钙依赖膜结合蛋白、Rab GDPα分离抑制剂，占蛋白总数的30.3%；以及2种抗氧化相关蛋白，包括过氧化氢酶和过氧化物酶2等，占蛋白总数的3.03%。

表1 大鲵皮肤黏液蛋白鉴定结果Table 1 Identification results of skin mucous water-soluble protein

(续表1)

以上蛋白经蛋白GO Biological Progress注释，发现66种蛋白参与30种生物学过程。其中参与糖酵解和小GTP酶介导信号转导的蛋白最多，分别占总蛋白的15.91%和9.09%(表2)。KEGG 注释结果显示，66种蛋白主要参与30种生化代谢途径和信号转导途径，其中主要包括氨基酸的生物合成(9.9%)、糖酵解(9.9%)、碳代谢(8.9%)、泛素介导的蛋白水解(7.9%)。

表2 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白参与的生物学过程Table 2 Biological process of skin mucous water-soluble protein %

3 讨 论

3.1 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白的免疫功能

许多鱼类及两栖类皮肤具有一种非特异免疫系统，能够抵御外来病原体的入侵，并且具有一定的广谱性，可以对很多病原体起到抑制或杀灭的作用。大鲵皮肤是抵抗外源入侵的第一道防线，在抵抗病原体入侵中发挥重要功能[15]。大鲵皮肤中含有大量的活性物质，包括生物胺、生物碱、类固醇、蛋白质和多肽等[16]，这些物质在皮肤功能发挥上扮演着重要角色，是宝贵的生物资源。

本试验发现大鲵皮肤黏液水溶性蛋白能够凝集大肠杆菌和嗜水气单胞菌，可能具有抗菌功能。在大鲵皮肤水溶性蛋白的质谱结果中发现了20种免疫相关蛋白，很可能与大鲵皮肤抵御病原微生物入侵的功能有关。这些蛋白包含有很多泛素化相关蛋白，包括泛素、泛素结合酶、泛素碳末端水解酶、NEDD8-泛素缀合酶、泛素缀合酶等。蛋白泛素化是由泛素激活酶、泛素活化酶和泛素连接酶3种酶通过活化、结合和连接3步级联反应对靶蛋白进行修饰进而降解靶蛋白的过程[17]。有研究显示，当机体受到细菌等病原体侵袭时，泛素可以通过介导促凋亡蛋白Bcl-2的降解从而抑制巨噬细胞的凋亡，进而维持机体的免疫应答[18]，巨噬细胞会释放泛素连接酶激活下游NF-κB信号通路促进炎症因子的表达，从而清除病原微生物[19]。大鲵皮肤黏液中也有多种与小GTP酶信号转导相关蛋白，包括Rab蛋白、ADP核糖基化因、GTP-结合蛋白、Rab GDPα分离抑制剂。小GTP酶包括Ras (Rat sarcoma viral oncogene homology)、Rho (Ras homolog gene family)、Arf、Ran(a small nuclear GTP-binding protein)和Rab等五个家族，参与调节细胞和细胞-基质的相互作用、调节动态肌动蛋白重排、细胞内转运等多种功能[20]。中性粒细胞作为先天免疫系统的一部分，是抵御病原体的第一道防线[21]，多种小GTP酶能够调节其粘附、传播、极化、趋化、富集、吞噬以及自噬[20]等多种功能。有研究表明，Rab27蛋白使中性粒细胞快速向感染处富集，释放炎症因子杀死病原微生物[22]，Rab5能够调节中性粒细胞的吞噬活性清除入侵的细菌[23]。除此之外，热休克蛋白在诱导先天免疫和适应性免疫都发挥着重要作用[24-25]。硒结合蛋白与口臭、癌症和精神分裂症的疾病有关[26]，钙结合蛋白与肿瘤细胞迁移[27]、血管生成以及炎症[28]有关。

3.2 大鲵皮肤黏液水溶性蛋白的抗氧化性能

大鲵皮肤黏液水溶性蛋白表现出显著的氧化物的清除能力。本研究发现大鲵皮肤黏液分泌蛋白对DPPH、NO、ABTS等物质具有较好的清除效果，说明其具有良好的抗氧化作用。根据蛋白质谱结果，抗氧化性很可能是由过氧化氢酶和过氧化物酶2发挥的。除了这2种抗氧化酶，大鲵皮肤黏液水溶性蛋白中可能还有其它的抗氧化物质，例如HSP70能够抑制氧化后的蛋白积累并促进氧化蛋白质的降解[29]以减少机体氧化损伤。有研究表明大鲵皮肤炮制酒能够提高谷胱甘肽的含量及SOD活性，从而提升机体抗氧化能力，降低过度饮酒引起的氧化应激反应[30]。从不同育龄大鲵的皮肤黏液中提取出的低聚糖肽也具有良好的抗氧化性，对羟自由基和DPPH具有较高的清除率[31]。抗氧化活性物质去除的自由基等氧化物是机体代谢过程中产生的[32]，此外当机体收到病原体感染发生炎症时，也会产生自由基[21]，这些自由基会对机体正常组织造成损伤，延缓组织愈合。大鲵皮肤黏液中的抗氧化物质能够清除这些自由基，这可能对大鲵伤口愈合和机体代谢有着重要作用。例如在红瘰疣螈皮肤中发现一种短肽能够促进伤口的愈合[33]，涂抹大鲵皮肤制作的药膏能够促进小鼠背部烧伤愈合[10]，这些都说明两栖类有尾目的黏液能够促进伤口愈合，而这些很可能与皮肤中的抗氧化活性物质有关。

4 结 论

本试验发现大鲵皮肤黏液水溶液中含有66种水溶性蛋白，其中20种蛋白与免疫抗病功能相关，2种蛋白与抗氧化活性相关，参与免疫和代谢在内的多种生理过程，并且具有明显的抗菌活性和抗氧化活性。