分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中的10种利尿剂

赵晓亚*， 陈新艳， 王 晗， 叶 诚， 曹 维， 郑茜玥， 王 鹏

(武汉海关技术中心，湖北武汉 430050)

利尿剂是临床常用药物，广泛应用于利尿消肿、降压和脑水肿等的治疗。近年来，利尿剂也被用于家畜的养殖及疾病治疗中，因而在许多动物源性食品可能存在残留。利尿剂进入人体后，可直接或间接导致肾脏功能和组织学改变，通过细胞外容量的减少、入球和出球小动脉张力的改变和球-管反馈等机制，导致肾血流量的减少和肾小球滤过率的下降。其还可引起急性间质性肾炎、肾小管堵塞等肾脏损害，长期摄入利尿剂可导致肾结石、尿沉渣异常和低钾性肾病等慢性改变，具有较强的肾毒性作用[1 - 8]。

目前，文献报道的利尿剂的检测方法主要是高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术，检测对象集中在人体及动物的尿液[9 - 12]和血液[13,14]、饲料[15]、保健品或者功能食品[16 - 18]等。针对动物源性食品中利尿剂的检测方法报道非常少。因此，本文建立了猪肉中氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮10种利尿剂残留的高效液相色谱-串联质谱分析方法，该方法具有快速、灵敏、定性定量准确的特点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QTRAP 5500液相色谱-串联质谱联用仪(美国，AB SCIEX)；GM200刀式研磨仪(德国，Retsch)；ML303/02电子天平(美国，METTLER TOLEDO)；2-16PK型低温离心机(德国，Sigma)；MS2型漩涡混合仪(德国，IKA)，TurboVap LV型氮吹仪(瑞典，Biotage)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore)。

10种利尿剂标准品：氢氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,Dr)、氯噻嗪(Chlorothiazide,Dr)、氨苯喋啶(Triamterene,TMstandard)、丙磺舒(Probenecid,CATO)、氯噻酮(Chlorthalidone,TMstandard)、乙酰唑胺(Acetazolamide,LGC)、呋塞米(Furosemide,TMstandard)、精磺胺(4-Amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide,TMstandard)、螺内酯(Spironolactone,BePure)、坎利酮(Canrenone,TMstandard)，纯度≥98%。分别称取10种利尿剂标准品，用甲醇溶解(氨苯喋啶先用少量冰HAc溶解)，配制成质量浓度为0.5 mg/mL标准储备溶液，于-18 ℃保存。在实验过程中精确吸取适量标准溶液，用甲醇溶液逐级稀释至所需分析物浓度。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck)；KH2PO4、无水MgSO4(分析纯)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、石墨化碳黑(GCB)用于实验。

猪肉样品购于武汉集贸市场。

1.2 样品前处理

称取2 g试样，置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈和2 g KH2PO4，振荡提取30 min后，于0 ℃以9 000 r/min离心5 min，取出上清液，再向残渣中加入10 mL乙腈重复提取1次，离心后合并上清液，置于50 mL离心管中，待净化。

在待净化上清液中加入150 mg无水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB，涡旋混合30 s后，于0 ℃以9 000 r/min离心5 min，取全部上清液于45 ℃下用氮气吹至近干，准确加入2.0 mL初始流动相溶液溶解残渣，溶液过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流动相为水(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)。梯度洗脱程序：0～1.0 min，B保持10%；1.0～3.5 min，B从10%变为65%；3.5～11.0 min，B从65%变为97%；11.0～11.5 min，B从97%变为10%；11.5～15.0 min，B保持10%。流速0.3 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃。

1.3.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正负离子扫描；多反应监测(MRM)模式检测；气帘气压力(CUR，kPa)：241(氮气)；雾化气压力(GS1，kPa)：414(氮气)；辅助气压力(GS2，kPa)：355(氮气)；正离子扫描电喷雾电压(IS)：5 000 V；负离子扫描电喷雾电压(IS)：-4 500 V。碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)等。主要质谱参数如表1所示。

表1 10种利尿剂的主要参考质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 10 kinds of diuretics for LC-MS/MS

2 结果与讨论

2.1 溶液稳定性

本工作对标准储备溶液和混合标准中间溶液的稳定性进行了考察。10种利尿剂的0.5 mg/mL储备溶液在-18 ℃保存条件下，在1、10、20、30、45、60、75、90 d时，分别取10种利尿剂的储备溶液用甲醇混合稀释成10.0 ng/mL，考察了储备溶液的稳定性。1.0 μg/mL混合标准中间溶液在4 ℃保存条件下，在1、10、20、30、45 d 时用甲醇混合稀释成10.0 ng/mL，考察了混合标准中间溶液的稳定性。结果表明，在90 d内标准储备溶液变化为99.4%～99.7%，在45 d内混合标准中间溶液变化为99.6%～99.1%。

2.2 提取条件的选择

10种利尿剂均为具有一定极性的化合物，适合采用极性溶剂进行提取，故用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作为提取溶剂进行了提取效果对比。在空白基质中添加20 μg/kg的利尿剂标准品作为测试样品，结果表明乙腈的提取率较高且干扰少。对比了在提取过程中加入无水N2SO4、KH2PO4、无水MgSO4、NaCl、柠檬酸钠对提取效率的影响，结果表明加入KH2PO4时的回收率比较高。

2.3 净化条件的选择

常用的QuEChERS净化材料包括PSA、C18和GCB，通常还会加入无水MgSO4去除水分。本实验采用正交试验对各净化剂的用量进行了优化，正交试验条件如表2所示。不同净化剂比例条件下的净化结果如表3所示。结果表明，第2组净化剂比例条件下的净化效果较好。因此，在后续净化中采用150 mg无水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB这一添加比例。

表2 正交试验表Table 2 Parameters for orthogonal test

表3 不同吸附剂比例对净化效果的影响Table 3 Purification effect of different amount of adsorbents

2.4 线性关系、检出限和重现性

在最优的实验条件下，方法学考察表明，猪肉中氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的检出限为2.0 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg；乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮的检出限为5.0 μg/kg，定量限为10.0 μg/kg。图1为空白猪肉基质中添加10种利尿剂定量限浓度的提取离子色谱图。氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的线性范围为5～100 μg/L，乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮的线性范围为10～200 μg/L，线性关系如表4中所示。

表4 猪肉中10种利尿剂的线性关系Table 4 Linear relationship of 10 kinds of diuretics in pork

图1 空白猪肉基质及其添加10种利尿剂的提取离子色谱图。(A)正离子模式空白样品；(B)正离子模式加标样品;(C)负离子模式空白样品；(D)负离子模式加标样品。Fig.1 Extracted ion chromatograms of blank pork and spiking sample.(A)Blank sample of positive ion mode;(B)Spiked sample of positive ion mode(Triamterene：5.64 min,probenecid:9.33 min,spironolactone:9.42 min,canrenone:9.86 min);(C)Blank sample of negative ion mode;(D)Spiked sample of negative ion mode(Hydrochlorothiazide:4.86 min,chlorothiazide:4.71 min,chlorthalidone:6.23 min,acetazolamide:5.01 min,furosemide:7.02 min,4-amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide:4.13 min).

2.5 方法的回收率和精密度

将本方法应用于市售的猪肉样品中10种利尿剂的检测，在实际样品中均未检出。因此，采用经测定不含目标物的猪肉样品进行加入回收率和精密度实验，结果见表5。10种利尿剂在空白猪肉基质中不同浓度水平的添加回收率在83.5%～96.6%之间，精密度(RSD)小于10.1%。

表5 猪肉样品中10种利尿剂的加标回收率(n=7)Table 5 Recoveries of 10 kinds of diuretics in pork samples(n=7)

(续表5)

3 结论

本方法利用乙腈进行提取，分散固相萃取净化，高效液相色谱-串联质谱法对猪肉样品中10种利尿剂残留进行定性与定量检测。该方法具有快速、准确、灵敏的特点，可用于日常猪肉样品中氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮残留的定性及定量检测。