基于CdSe/ZnS量子点构建乙酰甲胺磷荧光检测方法研究

程 杨， 刘红弟， 匡立学， 徐国锋*

(中国农业科学院果树研究所，农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心(兴城)，辽宁兴城 125100)

乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷(图1)，化学名为O,S -二甲基-N-乙酰基硫代磷酰胺。它是一种内吸杀虫剂，主要抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶，具有胃毒和触杀作用，有一定的熏蒸作用，是缓效型杀虫剂。该杀虫剂主要用于防治蔬菜、果树、水稻、棉花以及小麦等作物上的害虫。在实际果蔬种植中，乙酰甲胺磷的过量、不规范使用易使其残留于果蔬中，进而危害人体健康。我国规定乙酰甲胺磷在果蔬中的最大残留限量值(MRL)为0.5～1.0 mg/kg[1]。目前，乙酰甲胺磷的检测方法主要有气相色谱法(GC)[2]、高效液相色谱法(HPLC)[3]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[4]。但这些方法具有易受基质干扰，分析过程比较繁琐且时间冗长、仪器设备昂贵等缺点。因此，建立一种简便、灵敏度高、准确性好的乙酰甲胺磷检测方法具有重要的现实意义。

图1 乙酰甲胺磷的化学结构式Fig.1 Chemical structure of acephate

量子点(Quantum Dots，QDs)是由Ⅱ-Ⅳ族或Ⅲ-Ⅴ族元素所组成的、粒径介于1～100 nm之间，三维受限、近似球状的无机半导体纳米晶体[5,6]。与传统的有机荧光染料相比，量子点具有荧光量子产率高、激发光谱宽、发射光谱窄、抗光漂白能力强、光学稳定性好以及易于修饰等特性[7,8]。这些优越的荧光性能已引起国内外科研工作者们的广泛关注。目前量子点已广泛应用于生物成像分析[9,10]、重金属离子检测[11,12]、生物标记[13]、药物测定[14]以及DNA和蛋白质的检测[15,16]等前沿科学领域。然而，已有的单核量子点(例如CdSe、CdTe等)表面缺陷较多，荧光效率较低，光致氧化的稳定性也较差。与单核量子点相比较，核-壳型量子点(例如CdSe/ZnS、CdSe/CdS)具有更好的发光效率及稳定性，并且其毒性较低，使核-壳型量子点具有非常大的应用前景[17]。本研究基于乙酰甲胺磷对油溶性核-壳型CdSe/ZnS QDs发生荧光的灵敏猝灭特性，以此建立了一种简单、灵敏度高、选择性好且成本低的乙酰甲胺磷检测新方法，该方法可应用于水果和蔬菜中农药乙酰甲胺磷的快速检测，拓展了荧光量子点的应用范围。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光光谱仪(日本，日立公司)；U-3900型紫外光谱仪(日本，日立公司)；雷磁pHS-3E型数显式pH计(上海仪电科学仪器有限公司)；Tecnai G2 F30型高分辨率透射电子显微镜(美国，美国FEI公司)；TGW16型离心机(长沙英泰仪器有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；Milli-Q Direct 8超纯水系统(美国，Millipore公司)；四面通荧光石英比色池(1 cm×1 cm)。

乙酰甲胺磷农药标准品购自于农业农村部天津环境保护科研监测所，质量浓度为1 000 μg/mL，放置于4 ℃ 冰箱中保存备用。实验时用正己烷稀释得到标准工作溶液。油溶性CdSe/ZnS QDs(浓度约为4.0×10-5mol/L，激发波长282 nm，发射波长594 nm，荧光量子产率为80%)购自武汉珈源量子点技术开发有限公司；其它实验试剂均为分析纯。实验用水使用Milli-Q Direct 8超纯水系统进行纯化。

苹果及芹菜样品均购买于辽宁省兴城市东伟超市。

1.2 荧光光谱测定

将分散在正己烷中的100 μL 1.0×10-5mol/L的CdSe/ZnS QDs溶液加入到10 mL的比色管中，再加入不同浓度的乙酰甲胺磷溶液，用正己烷溶液定容至10 mL，充分混匀后反应5 min，在常温下进行荧光光谱扫描。以282 nm为激发波长，记录594 nm发射波长处的荧光强度，用于乙酰甲胺磷的分析检测。

1.3 实际样品分析

准确称取匀浆后的苹果和芹菜样品各25 g，置于100 mL烧杯中，分别加入50 mL乙腈提取样品中的农药成分，以3 000 r/min混匀2 min，将匀浆液过滤后，转移到装有7 g NaCl的100 mL量筒中，混匀2～3 min，静止放置0.5 h。移取上清液10 mL，40 ℃下N2吹干，重新溶解于正己烷并定容至10 mL，进行荧光光谱的分析测定。

2 结果与讨论

2.1 CdSe/ZnS QDs的表征

利用高分辨透射电子显微镜(HRTEM)对油溶性CdSe/ZnS QDs进行观测(图2(a))，从图中可清晰看到CdSe/ZnS QDs颗粒近似球型，外观尺寸均一，总体分散性较好，粒径大小约为3.5 nm。从图2(b)中可以看出，在紫外光(365 nm)激发下，CdSe/ZnS QDs能够被有效激发，发出黄色的荧光。根据文献报道[18]，不同的量子点粒径尺寸，能够使其显现出不同的颜色。

图2 CdSe/ZnS QDs的透射电镜(TEM)图(a)和在紫外光激发下的图像(b)Fig.2 TEM image of CdSe/ZnS QDs(a) and the photo of CdSe/ZnS QDs under ultraviolet light(b)

图3为CdSe/ZnS QDs的紫外-可见吸收光谱图及荧光光谱图。由紫外-可见吸收光谱可见，CdSe/ZnS QDs紫外吸收峰位于564 nm，依据紫外吸收光谱经验公式[19]：D=(9.8127×10-7)λ3-(1.7147×10-3)λ2+1.0061λ-194.84(其中D为粒径，λ为最大紫外吸收波长)，计算得CdSe/ZnS QDs的粒径为3.2 nm，表明CdSe/ZnS QDs的粒径分布均匀，并与TEM表征结果(3.5 nm)较吻合。由图3还可以看出，CdSe/ZnS QDs最大激发峰在282 nm时，荧光发射峰位于594 nm处，半峰宽约为30 nm，进一步表明此油溶性CdSe/ZnS QDs尺寸分布较窄，发光性能较好。

图3 CdSe/ZnS QDs的紫外-可见吸收光谱(a)及荧光发射光谱图(b)Fig.3 UV-Vis absorption spectrum (a) and fluorescence emission spectrum(b) of CdSe/ZnS QDs

2.2 CdSe/ZnS QDs用于农药乙酰甲胺磷检测

2.2.1 反应时间的影响当向CdSe/ZnS QDs溶液中加入乙酰甲胺磷(浓度为5.46×10-6mol/L)后，每隔1 min测定1次溶液体系的荧光强度(1～30 min)。实验结果表明，当加入乙酰甲胺磷后，CdSe/ZnS QDs的荧光强度迅速发生猝灭，并且在5 min之后达到稳定，5 min时荧光信号响应达到最大值，此后随着时间的增加荧光信号保持不变(稳定30 min左右)。因此，实验中选择反应5 min后测定体系的荧光强度。

2.2.2 线性范围及检出限从图4可知，乙酰甲胺磷可有效猝灭CdSe/ZnS QDs的荧光，且猝灭程度随乙酰甲胺磷浓度的增大而增加，表明采用CdSe/ZnS QDs测定乙酰甲胺磷具有一定可行性。在最优实验条件下，考察了CdSe/ZnS QDs的荧光强度变化值(F0/F)与乙酰甲胺磷浓度(c)之间的关系(其中F0是不含乙酰甲胺磷时体系的荧光强度，F是含有不同浓度乙酰甲胺磷时体系的荧光强度)。结果表明：当乙酰甲胺磷的浓度在0.487×10-6～7.225×10-6mol/L范围内时，CdSe/ZnS QDs的F0/F与c之间呈现较好的线性关系，其线性回归方程为：F0/F=1.17c+0.322(R2=0.9987)，方法检出限(3σ)为2.55×10-7mol/L。对乙酰甲胺磷溶液进行11次平行测定，体系荧光强度变化的相对标准偏差为2.14%。

图4 CdSe/ZnS QDs随乙酰甲胺磷浓度变化的荧光光谱图Fig.4 Fluorescence spectra of CdSe/ZnS QDs varying with concentration of acephateCurve 1 - 13：0，0.487，0.695，1.092，1.354，1.905，2.263，3.108，4.368，5.460，7.225，8.664，9.736 μmol/L.

2.3 农药增稠剂及稳定剂的影响

在最优实验条件下，考察了一些常见的农药增稠剂及稳定剂，如：乙二醇、丙三醇、异丙醇、硅酸铝镁、对苯二酚、聚乙二醇及甲醛等对CdSe/ZnS QDs荧光强度的影响，结果如图5所示。这些常见的农药增稠剂及稳定剂均对CdSe/ZnS QDs的荧光没有明显的影响(p>0.05)。

图5 一些常见的农药增稠剂及稳定剂对CdSe/ZnS QDs荧光强度的影响Fig.5 Effects of some common thickeners and stabilizers on the fluorescence intensity of CdSe/ZnS QDs1:Control；2:Ethylene glycol；3:Glycerol；4:Isopropanol；5:Magnesium aluminoslilcate；6:Hydroquinone；7:PEG；8:Formaldehyde，the concentration of CdSe/ZnS QDs is 1.0×10-7 mol/L.

2.4 可能的荧光响应机制

根据上述分析，随着乙酰甲胺磷浓度的增加，CdSe/ZnS QDs的荧光强度发生规律性的猝灭现象。根据相关文献报道[20]，一般情况下能量转移以及量子点表面效应都会引起体系荧光强度的猝灭。图6显示了乙酰甲胺磷的紫外-可见吸收光谱和CdSe/ZnS QDs的发射光谱。从图中我们可以看出乙酰甲胺磷的紫外-可见吸收光谱与CdSe/ZnS QDs的发射光谱没有发生重叠现象，说明乙酰甲胺磷与CdSe/ZnS QDs之间并没有发生能量转移。

图6 乙酰甲胺磷的紫外-可见吸收光谱(a)和CdSe/ZnS QDs的发射光谱(b)Fig.6 UV-Vis absorption spectrum of acephate(a) and emission spectrum of CdSe/ZnS QDs(b)

从图7A可以看出，在向体系中加入乙酰甲胺磷之前，CdSe/ZnS QDs的粒径分布较均匀，总体分散性较好，没有发生明显的团聚现象。当向CdSe/ZnS QDs溶液中加入乙酰甲胺磷后，其TEM图像中也没有发生明显的团聚以及尺寸变化(图7B)。实验结果说明CdSe/ZnS QDs的荧光被乙酰甲胺磷猝灭并不是由于乙酰甲胺磷诱导CdSe/ZnS QDs团聚或尺寸减小引起的。并且从荧光光谱图(图4)也可以看出，当乙酰甲胺磷浓度在0.487×10-6～9.736×10-6mol/L范围内变化时，CdSe/ZnS QDs的荧光光谱也没有出现明显的红移或蓝移。表明加入乙酰甲胺磷之后，CdSe/ZnS QDs没有发生明显的团聚或尺寸减小，并没有发生量子点表面效应。

图7 加入乙酰甲胺磷前(A)和加入乙酰甲胺磷后(B)的CdSe/ZnS QDs的透射电镜(TEM)图Fig.7 TEM images of CdSe/ZnS QDs before(A) and after(B) the addition of acephate

有研究表明[20]量子点表面的有机分子对其荧光性质有较大影响。一些小分子和量子点结合后会影响量子点中电子和空穴的复合过程，导致发光强度的改变。因此可知，乙酰甲胺磷与CdSe/ZnS QDs之间的相互作用，有可能增大了CdSe/ZnS QDs的表面缺陷和非辐射重组的发生，导致CdSe/ZnS QDs荧光动态猝灭。

2.5 实际样品测定

通过加入回收实验对苹果和芹菜样品中农药乙酰甲胺磷的含量进行测定，结果如表1所示。农药乙酰甲胺磷的加标回收率为94.5%～102.8%，相对标准偏差(RSD，n=5)在2.1%～3.8%范围内，表明该方法具有较好的实际应用可行性。

表1 苹果和芹菜样品中农药乙酰甲胺磷的分析结果(n=5)Table 1 Analytical results of acephate in apple and celery samples(n=5)

3 结论

本研究基于乙酰甲胺磷与油溶性CdSe/ZnS QDs之间的相互作用，建立了一种快速测定乙酰甲胺磷的荧光分析方法。在最佳的实验条件下，方法线性范围0.487×10-6～7.225×10-6mol/L，相关系数R2=0.9987，检出限为2.55×10-7mol/L。该方法灵敏度高、选择性好、操作简单，可用于水果和蔬菜中乙酰甲胺磷的快速检测。