基于金纳米颗粒/碳化氮-金属有机框架材料Cd-MOFs-74的C-反应蛋白免疫传感器的研制

赵潇澜， 谢发婷， 迟宽能， 杨云慧， 胡 蓉

(云南师范大学化学化工学院，云南昆明 650500)

快速、可靠地检测生物标志物在疾病的诊断中起着至关重要的作用。C-反应蛋白(CRP)是炎性淋巴因子(白介素-6IL-6、白介素-1IL-1、肿瘤坏死因子TNF)在肝细胞和上皮细胞中合成的急性期炎性蛋白。血清中CRP含量异常被证明与许多疾病有关，包括细菌或病毒感染的脑膜炎、心血管疾病(高血压、高血脂等)、骨髓炎、新冠肺炎、冠心病等[1 - 4]。临床上可通过分析CRP浓度对患心血管疾病的风险进行评估[5]。因此，发展CRP的定量分析方法对于预测心血管疾病发生的可能性具有重要意义。目前临床上检测CRP的方法主要是比浊法[6]、局部表面等离子体共振[7]、酶联免疫分析[8]和荧光法[9]等。但这些方法大多数具有仪器价格昂贵、灵敏度低等缺点。电化学生物传感器具有简单、灵敏度高和易于操作等优点[10]，可用于实时检测抗原-抗体反应[11]，在临床诊断、食品安全、食品质量、生物学分析和环境监测中得到了广泛的应用[12]。

金属有机框架材料(MOFs)是近十年来迅速发展的一种具有三维孔结构的配位聚合物。目前MOFs在催化[13]、储能[14]、生物传感[15]和分离[16]等多个领域都有广泛的应用。碳化氮作为一种新型富氮的类石墨相二维碳纳米材料，具有优良的半导体特性，已被广泛运用于催化[17]、光电[18]、电池[19]等诸多领域。本实验基于金纳米颗粒/碳化氮(Au NPs@C3N4)与多孔框架材料Cd-MOF-74，构建了一种新的夹心型免疫传感器用于CRP的定量检测。用Au NPs@C3N4提供大的比表面积，用于固定CRP抗体(anti-CRP)，可以提高传感器的灵敏度。多孔有机框架材料Cd-MOF-74为信号标签，通过检测MOFs材料中Cd2+的信号，构建了夹心型免疫传感器实现对CRP的定量检测。之前的报道中，我们将Fe-MIL-88作为信号标签时只检测到MOFs中的配体峰[20]，并未检测到离子峰，但以Cd-MOF-74作为信号标签时，既检测到MOFs中的配体峰也检测到Cd2+的峰，且离子峰的信号更强。该免疫传感器在与CRP相关的疾病监测和临床诊断的生物学应用中显示出巨大的潜力。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

电化学工作站(CHI650E，上海辰华仪器公司)；真空干燥箱(DZF-6020，上海博讯实验有限公司)；电子分析天平(ME104E，德国赛多利斯集团)；透射电镜(JEM 2100，日本电子株式会社)；高速冷冻离心机(TGL16，长沙湘智离心机仪器有限公司)；超声波清洗机(ST2200HP，上海科导超声仪器有限公司)。

CRP、anti-CRP(上海领潮生物科技有限公司)；0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.138 mol/L NaCl，pH=7.4)(Solarbio公司)；2,5-二羟基对苯二甲酸(DHTA)、CdAc2·2H2O(上海阿拉丁试剂有限公司)；牛血清蛋白(BSA，广州赛国生物科技有限公司)；柠檬酸三钠(盛奥化学试剂有限公司)；HAuCl4(国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸(广东西陇化工厂)；冰HAc、无水乙醇、甲醇(广东光华科技股份有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，风船化学试剂有限公司)；类石墨相碳化氮(C3N4，先丰纳米材料科技有限公司)；Na2HPO4·12H2O(盛奥化学试剂有限公司)；无水NaAc(上海麦克林生化科技有限公司)；人反应C蛋白ELISA试剂盒(上海江莱科技有限公司)。所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2 材料制备

1.2.1 Au NPs的合成参照文献方法[21]，将50 mL去离子水与500 μL 1%HAuCl4加入到100 mL圆底烧瓶中，加热搅拌至沸腾后，立即加入1.75 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，在沸腾状态下持续搅拌直至溶液变为酒红色，冷却至室温后，于4 ℃避光保存。

1.2.2 Au NPs@C3N4的制备将0.05 g C3N4超声分散于20 mL的灭菌水中，在不断搅拌的条件下滴加20 mL Au NPs，室温搅拌48 h。以8 000 r/min的转速离心3 min，灭菌水洗涤3次，最终分散于5 mL的灭菌水中，4 ℃避光保存。

1.2.3 Cd-MOF-74的合成参照文献报道的方法[22]，称取0.4 g DHTA超声分散于10 mL DMF中得到A液；称取1.398 g CdAc2·2H2O分散于30 mL DMF中得到B液。将A液缓慢滴加至B液中，并超声30 min。而后将混合液转移至反应釜中，在125 ℃反应20 h，待反应结束且冷却至室温后，抽滤，DMF和甲醇分别洗涤3次(10 mL×3)。抽滤产物用甲醇浸泡一周，每隔24 h更换一次，7 d后抽滤得到产物，于60 ℃真空干燥12 h，得到黄色晶体。

1.2.4 Au NPs@Cd-MOF-74的制备将15 mL合成的Au NPs逐滴加入分散于25 mL灭菌水的0.1 g Cd-MOF-74中，搅拌12 h。离心，灭菌水洗涤3次，分散于4 mL灭菌水中，4 ℃保存备用。

1.2.5 Au NPs@Cd-MOF-74标记anti-CRP取400 μL合成的Au NPs@Cd-MOF-74，加入600 μL灭菌水，摇振均匀。再取10 μL 1 mg/mL anti-CRP，按2 μL/times间隔3 min加入，于4 ℃振摇2 h。而后加入25 μL 10%BSA，4 ℃继续振摇30 min。以4 000 r/min低温离心6 min，并用0.01 mol/L PBS洗涤2次，最终分散于1 mL PBS中，4 ℃保存备用。

1.3 免疫传感器的制备

玻碳电极(GCE,d=3 mm)用砂纸打磨，再在麂皮上用不同粒径的Al2O3粉末进行抛光。而后依次用HNO3(1∶1)、无水乙醇和去离子水各超声3 min后晾干。将合成的Au NPs@C3N4分散液与5%Nafion溶液按体积比1∶1混合，取10 μL混合液滴加到GCE表面，自然晾干，再滴加anti-CRP，于4 ℃过夜。将电极取出用PBS冲洗去除未结合的anti-CRP后，晾干，滴加1%BSA(10 μL)，于37 ℃下封闭非特异性结合位点1 h。而后将电极取出冲洗、晾干，再滴加不同浓度的抗原于37 ℃恒温培育1 h，PBS冲洗、晾干后，最后滴加10 μL Au NPs@Cd-MOF-74标记的anti-CRP，37 ℃培育1 h。夹心型电化学免疫传感器制备流程如图1所示。

图1 夹心型电化学免疫传感器的原理及制备Fig.1 The principle of sandwich electrochemical immunosensor

1.4 电化学测量

采用差分脉冲伏安法(DPV)，在-0.7至-0.9 V电位范围内进行测量；交流阻抗在1 Hz至100 kHz的频率范围内进行测量。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

2.1.1 微观形貌本文通过扫描电镜图(SEM)和透射电镜图(TEM)表征C3N4、Au NPs@C3N4、Cd-MOF-74及Au NPs@Cd-MOF-74的微观形貌。由图2A可见，C3N4是一种片层状的材料。Au NPs与C3N4混合均匀后，Au NPs吸附于C3N4表面得到Au NPs@C3N4复合物。如图2B所示，Au NPs均匀的分散在C3N4上。图2C则显示出Cd-MOF-74为典型的棒状结构，与先前文献的报道结果吻合[22]。当Cd-MOF-74吸附Au NPs后，其尺寸缩小且结构松散呈碎石状(图2D)。从图2E可见，Au NPs在Cd-MOF-74上分散均匀，说明Au NPs@Cd-MOF-74合成成功。

图2 C3N4(A)和Au NPs@C3N(B)的透射电镜(TCM)图,Cd-MOF-74(C)和Au NPs@Cd-MOF-74(D)的扫描电镜(SEM)图，Au NPs@Cd-MOF-74的TEM图(E)Fig.2 TEM images of C3N4(A) and Au NPs@C3N4(B),the SEM images of Cd-MOF-74(C) and Au NPs@Cd-MOF-74(D),the TEM image of Au NPs@Cd-MOF-74(E)

2.1.2 X射线衍射表征本实验采用X射线衍射(XRD)对合成的Cd-MOF-74的晶体结构进行表征，并与标准谱图进行比对。图3显示在2θ为7°与12°的峰与文献报道[22]一致，表明多孔有序的Cd-MOF-74成功合成。

图3 Cd-MOF-74的X射线衍射(XRD)图Fig.3 XRD pattern of Cd-MOF-74

2.1.3 电极修饰过程的电化学表征本实验在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含0.2 mol/L KCl)溶液中进行。由图4可见，曲线a为裸的GCE，它接近一条直线证明裸电极导电性优良；在电极上铺展一层Au NPs@C3N4作为基底之后，阻抗值比裸电极略有增大(曲线b)，由于修饰了Au NPs@C3N4和Nafion膜共同形成的界面对电子的传递有所阻碍；曲线c为在基底之上自组装了anti-CRP，此时阻抗值接近600左右，anti-CRP是一种蛋白质，本身不导电引起阻抗值增大；用1%BSA封闭非特异性位点后，BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4修饰电极后的电化学阻抗(曲线d)在曲线c的基础上进一步增大，因为BSA是一种不能传导电子的蛋白质；曲线e为滴加了CRP抗原的CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE，CRP抗体抗原特异性结合形成免疫复合物，进一步阻碍电子的传导；曲线f为Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP/CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4修饰在电极表面之后的电化学阻抗，MOFs标记的抗体与抗原结合后，修饰电极的阻抗进一步增大，表明Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP成功组装在电极上。从上述曲线阻抗值的逐步变化结果得出，此夹心型免疫传感器构建成功。

图4 不同电极的交流阻抗谱(EIS)Fig.4 The EIS of different modified electrodes(a)bare GCE;(b)Au NPs@C3N4/GCE;(c)anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(d)BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(e)CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(f)Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP/CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE.All tests were carried out in 10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4- containing 0.2 mol/L KCl.

2.2 Cd-MOF-74的响应峰电流来源

为了确认Cd-MOF-74的信号来源于Cd2+，本实验考察了DHTA在PBS中的DPV响应电流。由图5可见，配体DHTA与Cd-MOF-74在PBS中的响应电流峰的位置差别较大，其信号峰分别位于0.4 V和-0.8 V。Cd-MOF-74材料合成过程中，只含有Cd2+和DHTA，证实Cd-MOF-74产生的响应电流来源于Cd-MOF-74中的Cd2+。实验中检测到的电流信号为Cd-MOF-74中Cd2+的还原峰。

图5 Cd-MOF-74和DHTA在PBS中的电流响应Fig.5 Current response of Cd-MOF-74 and DHTA in PBS

2.3 实验条件优化

实验考察了HAc-NaAc、Na2HPO4-柠檬酸和柠檬酸-柠檬酸三钠三种缓冲体系(0.1 mol/L，pH=5)对免疫传感器的影响。为了排除其它因素干扰，抗体的浓度固定为40 μg/mL，抗原浓度选定为30 ng/mL。结果表明：在HAc-NaAc缓冲体系中，电流响应最大，但是目标与空白差值不明显；选用Na2HPO4-柠檬酸为缓冲体系时目标和空白相差无几；而在柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲体系中，峰电流差值最大。本实验选用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液作为底液。

考察了当培育抗原浓度保持在30 ng/mL，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液作为底液时，固定抗体浓度增加对响应电流的影响。由图6可见，随着anti-CRP浓度的增大，响应电流也随之逐渐增大。当抗体浓度达到40 μg/mL时，响应电流达到峰值，且此时目标和空白差值最大。继续增大抗体浓度，电流峰值反而有所下降。本实验选择40 μg/mL作为固定抗体的浓度。

图6 固定抗体浓度对免疫传感器响应电流的影响(内插图为目标与空白的差值)Fig.6 The effect of concentration of immobilized antibody on the response of immunosensors(inset graph is the current response between target and blank)

2.4 免疫传感器的响应性能

在最优条件下，分别对不同浓度抗原的免疫传感器的响应性能进行测试。图7A为免疫传感器的DPV响应电流与CRP蛋白浓度之间的关系。由图可见，响应电流随CRP浓度的增大而递增。图7B为免疫传感器的线性曲线。CRP浓度的对数与响应电流具有良好的线性关系，线性回归方程为：I(μA)=20.69lgc(ng/mL)+23.83，R2=0.994，线性范围为0.1～100 ng/mL，检出限(S/N=3)为33.3 pg/mL(图7B)。

图7 免疫传感器对不同浓度CRP的响应曲线(A)和免疫传感器的校正曲线(B)Fig.7 The current response of immunosensor to different concentrations of CRP(A) and calibration curves of immunosensor(B)

为了进一步验证本文构建的免疫传感器的性能，将此免疫传感器同文献所报道的CRP监测方法进行了比较。由表1可见，该免疫传感器具有较低的检出限，更高的灵敏度，且线性范围宽。其优良性能归功于：(1)作为基底材料的C3N4具有高比表面积和优良的导电性；(2)作为信号源的Cd-MOF-74是一种多孔、比表面积大且能提供大量金属活性位点的配位聚合物，在提供更多蛋白结合位点的同时，有着较强的响应电流信号。

表1 不同CRP检测方法对比Table 1 Analytical performance of correlative methods for CRP detection

2.5 免疫传感器的选择性

在最优条件下，分别将500 ng/mL的凝血酶(Thrombin)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)4种干扰物替换50 ng/mL的CRP抗原。从图8可知，仅加入CRP抗原电流信号显著增大，而干扰物(500 ng/mL)的电流信号和空白值相差不大。说明此传感器具有较好的抗干扰能力，选择性好，可用于检测C-反应蛋白。

图8 免疫传感器的选择性Fig.8 Selectivity of the immunosensor

2.6 回收率测定

在0.01%的血清稀释液中，采用标准加入法，分别加入3种不同浓度的CRP抗原(5、10、80 ng/mL)，以此评估本实验所构建的生物传感器的实用价值。每种浓度平行测定3组，回收率范围在98.4%～104.2%之间。由上述结果可知，本文设计的免疫传感器用于复杂真实环境时取得令人满意的结果，因此能够用于实际样品的检测。

2.7 免疫传感器的重现性

本实验在最优实验条件下，采用5根不同电极构建免疫传感器对50 ng/mL的抗原进行平行测定，其相对标准偏差为3.6%。因此，构建的免疫传感器具有良好的精密度和重现性。

2.8 与标准检测方法酶联免疫法比较

本实验采用标准人C反应酶联免疫试剂盒对CRP进行定量检测，结果显示紫外吸收光谱随CRP浓度的增加而上升，CRP浓度在375～12 000 ng/mL之间时，紫外吸收峰值与CRP浓度线性相关良好。线性方程为：A=1.304lgc(ng/mL)-3.332(R2=0.9683)，检测下限为125 ng/mL。将此测试结果与本实验所构建的夹心型免疫传感器进行了比较。本实验所提出的检测方法与ELISA Kits相比，具有更高的灵敏度(检测下限降低了3个数量级)。

仅对比检测范围与检测下限不足以说明本实验所提出的检测方法的准确性和实用性。我们采用本实验所提出的检测方法与人C反应ELISA Kits对同一真实血清样品再次进行了对比检测。因为，本实验所提出方法与ELISA Kits的标准曲线范围不在同一数量级且无重叠区域。为了严谨起见，ELISA Kits直接检测100%血清原液。而本实验构建的免疫传感器则检测稀释100倍后的1%血清，再通过稀释倍数计算得到血清原液中CRP的浓度。在真实血清样本中，本实验构建的免疫传感器同商业试剂盒对比仅有-3.4%的误差。结果证实所提出的夹心型免疫传感器有可靠的准确度，具有实用性。

3 结论

本实验基于Au NPs@C3N4与多孔有机框架材料Cd-MOF-74，构建了一种新的夹心型免疫传感器用于CRP的定量检测。本文构建的夹心型免疫传感器在CRP含量为0.1～100 ng/mL范围内具有较高的灵敏度，检出限(S/N=3)为33.3 pg/mL。将该免疫传感器在对实际血清样品中进行加标回收检测，并与ELISA Kits作对比。实验结果证明该夹心型免疫传感器在临床上CRP的监测中有良好的应用前景。