基于网络药理学及数据挖掘探讨中药调节细胞焦亡用药规律

梁子成，陈泓秀，文璐，张振，郭垠梅，田莎，黄晓蒂

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208

细胞焦亡是发生在炎性小体激活下游的细胞程序性死亡，是免疫反应的重要组成部分[1]。细胞焦亡可发生在巨噬细胞、神经细胞等诸多细胞，是神经系统、心血管系统等众多系统疾病的重要病机[2]。此外，细胞焦亡与肿瘤的增殖、侵袭及转移密切相关[3]。因此，积极探讨细胞焦亡相关机制、探索干预方法并开发相关药物已成为研究热点之一。

近年来，中药与细胞焦亡相关研究迅速增加，存在一定数量的中药干预细胞焦亡研究报道[4-6]。然而，现有报道多针对不同领域，且多为中药单体或单药调节细胞焦亡的作用研究，未能体现中药多种类、多靶点的作用特点。因此，系统研究细胞焦亡相关靶点、化合物及中药作用的物质基础和用药规律存在必要性。网络药理学集药理学、生物信息学等多学科优势于一体，可系统分析靶点、化合物及中药的关联性[7]。本研究采用网络药理学方法探讨细胞焦亡相关靶点、化合物与中药之间的关系，借助分子对接验证靶点与化合物的结合能力，分析相关中药的物质基础和用药规律，以期为中药调节细胞焦亡的理论探讨、临床研究及药物研发提供参考。

1 资料与方法

1.1 靶点获取及靶点机制分析

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、CTD（http://ctdbase.org/）、GenCLip 3（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）数据库，以“Pyroptosis”为关键词进行检索，获得细胞焦亡相关靶点。利用UniProt（https://www.uniprot.org/）、STRING（https://string-db.org/）数据库，选择物种为“Homo sapiens”，获得靶点全称。采用R3.6.3软件对靶点进行GO分析和KEGG富集分析。

1.2 候选化合物筛选及靶点-化合物网络构建

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）共纳入502味中药、13 729个化合物及相关的3 339个靶点，其中包含成药类似性正相关的类药性（drug likeness，DL）等信息[8]。以细胞焦亡相关靶点全称为检索词，通过TCMSP获取细胞焦亡相关化合物的名称、DL、PubChem CID等信息，以DL≥0.18为条件进行筛选，获得候选化合物。将潜在靶点、候选化合物导入Cytoscape3.8.0软件构建靶点-化合物网络，并利用其插件CytoNCA进行分析。

1.3 分子对接验证

为验证细胞焦亡相关靶点与候选化合物作用关系的结合度，根据靶点-化合物网络分析结果，选取度值前3位的靶点与度值前5位的化合物进行分子对接。通过PDB数据库（http://www1.rcsb.org/）以靶点蛋白全称获取蛋白质模型文件，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以PubChem CID获取小分子配体文件，经AutoDockTools处理后，使用AutoDock Vina进行分子对接，使用PyMOL软件作图及绘制氢键。

1.4 候选中药获取及靶点-化合物-中药网络构建

利用TCMSP收集含有候选化合物的中药，并根据2020年版《中华人民共和国药典》（一部）[9]、《中药学》[10]进行筛选得到候选中药，利用中医传承辅助平台V2.5进行中药性味归经分析，导入Cytoscape3.8.0软件构建靶点-化合物-中药网络并进行相关分析。

2 结果

2.1 细胞焦亡相关靶点及候选化合物

通过数据库检索获得细胞焦亡相关靶点139个，其中可通过TCMSP匹配到化合物的靶点34个，其中化合物DL≥0.18的相关靶点31个，将31个靶点定义为化合物作用于细胞焦亡的潜在靶点（见表1）。以潜在靶点名称与“DL≥0.18”为条件，通过TCMSP检索获得化合物101个，将其定义为细胞焦亡相关候选化合物，其中度值≥6的化合物见表2。

表1 化合物作用于细胞焦亡的潜在靶点

表2 细胞焦亡相关候选化合物信息（度值≥6）

2.2 潜在靶点机制分析

潜在靶点GO富集分析结果显示：生物过程（biological process，BP）主要参与脂多糖反应、对细菌来源分子的反应、I-κB激酶/NF-κB信号传导，细胞组分（cellular component，CC）主要与膜筏、膜微区、膜区等相关，分子功能（molecular function，MF）主要集中在细胞因子受体结合、半胱氨酸型肽链内切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等。KEGG富集分析结果显示，主要信号通路为NOD样信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路，此外，可能与细胞凋亡、沙门菌感染、甲型流感、志贺菌等相关。见图1。

图1 化合物作用于细胞焦亡的潜在靶点机制分析

2.3 靶点-化合物网络

将潜在靶点与候选化合物构建靶点-化合物网络（见图2），该网络由132个节点与313条边构成。网络中，度值前3位的靶点为CASP3、TNF、BCL2，分别与50、39、37个化合物相关；度值前5位的化合物为槲皮素（quercetin）、染料木黄酮（genistein）、表没食子儿茶素表没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、漆黄素（fisetin）、熊果酸（ursolic acid），分别与15、13、13、11、10个靶点相关。

图2 细胞焦亡相关靶点-化合物网络

2.4 分子对接结果

将高度值靶点CASP3、TNF、BCL2与高度值化合物槲皮素、染料木黄酮、表没食子儿茶素表没食子酸酯、漆黄素、熊果酸进行分子对接，靶点CASP3、TNF、BCL2的PDB ID分别为1RE1、2AZ5、6O0p。结合能＜-5.0 kcal/mol表示靶点与化合物结合活性较好。对接结果显示，各靶点与化合物的对接结合能均小于-6.0 kcal/mol，最低为-10.0 kcal/mol，最高为-6.3 kcal/mol。氢键数是评估靶点蛋白-分子配体结合能力的重要指标。对接结果显示，CASP3与槲皮素、表没食子儿茶素表没食子酸酯、漆黄素，TNF与表没食子儿茶素没食子酸酯均形成了5个氢键，表明其对接质量较好，见表3。依据结合能≤-7.5 kcal/mol及氢键数选择部分对接结果进行展示，见图3。

图3 细胞焦亡靶点与化合物分子对接示意图

表3 细胞焦亡相关高度值靶点与化合物分子对接结果

2.5 靶点-化合物-中药网络

通过TCMSP获得101个候选化合物的相关中药共423种，其中2020年版《中华人民共和国药典》（一部）及《中药学》收录373种，将其定义为候选中药。以潜在靶点、候选化合物及候选中药构建靶点-化合物-中药网络（见图4），网络中包含505个节点和1 742条边。度值前4位的中药为麻黄（70）、沙棘（70）、红花（68）、连翘（68），靶点数前4位的中药为沙棘（21）、杜仲（20）、女贞子（20）、枇杷叶（20），见图5。

图4 细胞焦亡相关靶点-化合物-中药网络

图5 细胞焦亡相关靶点-化合物-中药网络高度值和靶点数中药（前18位）

2.6 中药性味归经

应用中医传承辅助平台V2.5对373种候选中药进行性味归经分析，并依据2020年版《中华人民共和国药典》（一部）及《中药学》进行核对。结果以寒性（38.61%）、苦味（36.68%）及入肝经（21.48%）、肺经（16.78%）药物居多，见表4、表5、图6。

图6 调节细胞焦亡候选中药归经分析

表4 调节细胞焦亡候选中药药性分布

表5 调节细胞焦亡候选中药药味分布

3 讨论

有别于胀亡、自噬等细胞死亡方式，细胞焦亡表现为细胞表面形成孔洞，细胞膜破裂、胞内容物外漏等引发炎症反应[11-12]。细胞表面孔洞是由于GSDMD受到CASP3的特异性切割，其N末端生成的切片通过胞膜时形成，而CASP3激活又与肿瘤坏死因子（TNF）诱导作用有关[13-14]。细胞焦亡的发生和表现形式与肝、肾疾病[15-16]及脑损伤[17]、糖尿病[18]等发生发展相关。因此，对细胞焦亡相关靶点的机制进行系统研究，可为相关疾病研究提供理论参考。

对细胞焦亡潜在靶点的GO富集分析结果显示，潜在靶点参与的生物过程主要为脂多糖反应、对细菌来源分子的反应、I-κB激酶/NF-κB信号传导等。有研究发现，抑制脂多糖可通过非经典途径抑制细胞焦亡发生，其机制是外膜囊和冠苷基结合蛋白介导脂多糖直接与胞内Caspases家族受体结合，脂多糖可诱导Caspases激活，进而导致GSDMD发生裂解[19-20]，而病原体和危险相关分子模式可与胞膜上Toll样受体共同影响核因子-κB（NF-κB），触发炎性小体转录，炎性小体可介导焦亡发生[21]。潜在靶点主要与膜筏、膜微区、膜区等细胞组分相关，提示细胞焦亡形成过程中，孔洞形成位置可能与潜在靶点作用相关。潜在靶点的分子功能主要集中在细胞因子受体结合、半胱氨酸型肽链内切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等，显示潜在靶点主要与半胱氨酸的活性反应相关，而Caspases家族炎性蛋白酶的活性在焦亡发生过程中起决定性作用[22]。KEGG富集分析结果显示，细胞焦亡潜在靶点的主要相关信号通路为NOD样信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路等。研究发现，抑制NOD受体家族成员NLRP3的活化，可有效减少GSDMD N末端切片的生成，进而抑制细胞焦亡的发生[23]。Hu等[24]使用马钱子苷抑制NF-κB信号通路，可有效降低软骨基质分解代谢，抑制关节软骨的软骨细胞焦亡。Tavakoli等[25]发现，胚胎干细胞来源的外来体可抑制Toll样受体信号通路相关的TLR4介导的细胞焦亡。TNF-α是TNF信号通路的关键节点。Pei等[26]发现，TNF-α是三氧化二砷诱导细胞发生焦亡的关键靶点，并通过细胞实验表明，抑制TNF-α产生可有效减少焦亡的发生。KEGG富集分析结果提示，细胞焦亡可能与一些疾病和病理过程的发生存在关联性，如沙门菌、甲型流感病毒、志贺菌感染。沙门菌的致病性分泌系统与鞭毛可调节巨噬细胞焦亡，甲型流感病毒感染通过Ⅰ型干扰素信号通路引起呼吸上皮细胞发生焦亡，志贺菌可通过效应蛋白IpaB及其离子通道活性诱导巨噬细胞焦亡，从而对宿主感染产生保护性炎症反应[27-29]。综上可见，潜在靶点通过诸多机制参与调控细胞焦亡，富集分析的部分结果已在现有研究中得到较好的证实。同时，富集分析发现存在尚未报道的机制，可为后续相关领域研究提供参考，如焦亡发生的细胞多泡体定位、百日咳与细胞焦亡的关系等。

靶点-化合物网络、靶点-化合物-中药网络可直观体现中药的多种类、多成分、多靶点作用特点。CASP3是细胞焦亡的介导因子，在调节GSDMD裂解作用中起关键作用，CASP3缺失可导致免疫系统发生改变，引发组织器官发生损害[30]。TNF-α表达增加可促进焦亡的发生，而BCL2可减弱D275处CASP1、4、5对GSDMD的裂解，增强D87处GSDMD的裂解，两者均对细胞焦亡的发生具有调节作用[31-32]。本研究结果显示，多个化合物可与多个靶点发生相互作用，尤以槲皮素关联最多。研究发现，槲皮素可有效清除H2O2和HOCl，降低IL-1β水平，调节细胞焦亡的发生[33]。分子对接结果提示，靶蛋白与小分子配体结合能力较好，验证了靶点-化合物互动的可靠性，可为细胞焦亡相关的新药开发提供思路。

本研究发现，与细胞焦亡相关的中药主要有麻黄、沙棘、败酱草、杜仲、女贞子、金银花、半枝莲、木蝴蝶、白果等。麻黄、败酱草、杜仲、女贞子、金银花等所含山柰酚可通过抑制CASP1的表达和活性，增加TLR4、NLRP3的表达，抑制GSDMD分解，发挥抑制焦亡发生的作用[34-35]。灯盏花乙素为半枝莲有效成分，可调节CASP1活化及成熟IL-1β、HMGB1的释放，降低NLRP3的激活率，抑制焦亡发生[36-37]。木蝴蝶所含大黄素可通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路减轻心肌细胞损伤，抑制心肌细胞焦亡[38]。其余中药尚未见细胞焦亡相关报道，但有研究显示其有效成分或提取物存在干预炎性小体激活的作用[39-41]，有待进一步研究。

现有细胞焦亡相关中药研究多为单药或单药成分的动物实验和细胞实验，缺少相对全面系统的分析。本研究基于细胞焦亡相关中药的性味归经分析用药规律，可较好体现中药调节细胞焦亡的内在规律。细胞焦亡是一种炎性细胞死亡方式，以调控炎性小体来实现，而体内炎性因子聚集处多发生炎症发热反应，与中医“火毒”致病的认识相符。火毒所聚之处多出现发热、红肿等体征，用药以苦寒为主，辅以辛温，以防伤正。本研究结果显示，细胞焦亡相关中药以寒性、苦味最多，辛温等为辅，体现了中医“太过与不及”理论[42]。细胞焦亡相关中药多入肝经、肺经。肝主藏血、主疏泄，焦亡发生依赖于炎性因子的调控，炎性因子的产生和发挥作用离不开血液濡养与运行；而疏泄功能与炎性因子的代谢相关，可调控体内炎性因子的分布。肺主一身之气，协调全身气机运行，气机失常则痰湿内生，痰湿蕴久可内生火毒，同时痰湿也与焦亡的发生密切相关[43-44]。由此可见，中药调控细胞焦亡应注重对“火毒”的辨证施治，用药以苦寒清热解毒为主，辅以辛温，同时应注重维持肝的藏血与疏泄功能、协调肺等诸脏功能。

本研究虽联合多个数据库获得较为全面的细胞焦亡相关靶点，但因数据库信息更新等因素，可能导致化合物和中药收集不全。此外，本研究分析了靶点、化合物、中药之间的关系及其频次，但未考虑量效关系等实验和临床实际因素，所得结果有待进一步验证。