牛黄类药材及其伪品中27 种元素含量分析

栾 洁，丁 晴

1 江南大学 药学院，无锡 214000；2 无锡市药品安全检验检测中心，无锡214028

牛黄（Bovis Calculus）为我国传统名贵中药，药用历史悠久，是牛科动物牛（Bos taurus domesticus Gmelin）干燥的胆结石[1]，习称“天然牛黄”。其性甘、味凉，归心、肝经。具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒的功效，多用于热病神昏，中风痰迷、惊痫抽搐、癫痫发狂、咽喉肿痛、口舌生疮、痈肿疔疮[2]等症候。天然牛黄资源匮乏，价格昂贵，常需进口，国家先后批准了体外培育牛黄、人工牛黄，作为天然牛黄的代用品[3]。体外培育牛黄是以牛的新鲜胆汁，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成[2]，其与天然牛黄在成分、质量、药理作用等方面都较为相似。人工牛黄是由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成[1]。

电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽等优点，是目前元素测定较常用的方法。在中药材产地溯源、中药材及制剂质量评价、中药炮制加工等方面均有较多应用[4，5]。

牛黄含诸多种元素，在牛黄多种药理作用的发挥中起着至关重要的作用。本实验选取牛黄类药材（天然牛黄、人工牛黄、体外培育牛黄）及其伪品为研究对象，采用ICP-MS 法对27 种元素的含量进行测定，并对结果进行分析讨论，以期为3 类不同来源牛黄的快速鉴别提供依据。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Thermo iCAP Qc 电感耦合等离子体质谱仪（美国热电公司）；MARS 6 微波消解仪（美国CEM公司）；XSE 205DR 电子天平（梅特勒公司）。

1.2 药品与试剂

26 种元素（钠Na、镁Mg、铝Al、钾K、钙Ca、铅Pb、镉Cd、砷As、铜Cu、铍Be、钛Ti、钒V、铬Cr、锰Mn、铁Fe、钴Co、镍Ni、锌Zn、锡Sn、硒Se、锶Sr、钼Mo、银Ag、锑Sb、钡Ba、铊Tl）混合标准溶液（浓度为100 μg·mL-1，美国SPEX CertiPrep.公司）；内标（铋Bi、锗Ge、铟In、锂Li6、钪Sc、铽Tb、钇Y）混合溶液（浓度：10 μg·mL-1，美国SPEX CertiPrep.公司）；汞单元素标准溶液（浓度为1000 μg·mL-1，中国计量科学研究院）；金单元素标准溶液（浓度：1000 μg·mL-1，国家有色金属及电子材料分析测试中心）。

ICP-MS iCAP Q/RQ Tune Solution 含Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U，浓度为（1.00±0.05）μg·L-1（赛默飞世尔科技公司）；硝酸为优级纯；水为超纯水。

1.3 样品

3 类牛黄样品均从市场收集，经无锡药品安全检验检测中心中药室鉴定确认。样品信息见表1。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 仪器工作条件与测量条件

ICP-MS 工作条件：等离子体射频功率：1545 W，雾化气流量为1.04 L·min-1，冷却气流量为13.99 L·min-1，辅助气流量：0.788 L·min-1，碰撞气：He，碰撞气流量：3.92 L·min-1，测定模式：动能歧视（KED）模式。

测量方式及条件：采用标准曲线法，积分时间10s，延迟时间1s，重复3 次。根据测定元素的质量数，选取合适同位素，9Be、23Na、24Mg 以6Li 为内标；27Al、39K、

43Ca、47Ti、51V、52Cr、55Mn、56Fe 以45Sc 为内标；59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、82Se 以72Ge 为内标；88Sr、95Mo、107Ag 以89Y 为内标，114Cd、118Sn、121Sb 以115In 为内标；138Ba 以159Tb 为内标；202Hg、205Tl、208Pb 以209Bi 为内标。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准混合溶液精密量取26 种元素混合标准溶液（Na、Mg、Al、K、Ca、Pb、Cd、As、Cu、Be、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Sn、Se、Sr、Mo、Ag、Sb、Ba、Tl，浓度均为100 μg·mL-1）适量，用10%硝酸稀释制成浓度为0、10、50、100、250、500 ng·mL-1的系列浓度混合溶液。精密量取汞元素标准溶液（浓度1000 μg·mL-1）适量，用10%硝酸溶液稀释制成浓度为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng·mL-1的溶液（临用新配）。

2.2.2 内标溶液精密量取内标混合溶液适量，用水稀释制成浓度为1 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液取各样品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，置50 mL 聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸5 mL，于加热板上120 ℃预消解30 min，放冷，将消解罐置于微波消解仪中，按表2 的程序进行消解，冷却，将样品转移至50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗涤3 次，加入金单元素标准溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀释至刻度，摇匀，离心分取上清液，即得。

表2 微波消解程序

2.2.4 空白溶液备除不加金单元素标准溶液外，其余同“2.2.3”供试品溶液制备步骤。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察取标准混合溶液，按“2.1”测量条件进样测定，以进样浓度为横坐标，测量值（3次读数的平均值）为纵坐标，绘制标准曲线，得到Be、Na、Mg 等27 种元素的线性与范围。结果表明，各元素的标准曲线性关系良好，相关系数在0.992 9～0.999 7。线性回归方程见表3。

表3 线性关系考察、进样精密度、检出限及进样精密度

2.3.2 仪器精密度试验取26 种元素标准混合溶液（浓度为50ng·mL-1）和汞元素标准溶液（1ng·mL-1），按“2.1”测量条件连续进样6 次，计算各元素浓度的RSD 在0.5%～2.4%（n=6），结果见表3，表明仪器进样精密度良好。

海洋钻井公司规定，含油岩屑回收由平台提出申请，公司负责安排相应的船舶转运，并联系陆地有资质的单位来处理。每一个环节，都要求相关人员对岩屑运送情况做好如实记录，做好全过程的控制。

2.3.3 检出限设定取空白样品溶液，连续测定11次，计算各元素响应值的标准偏差（SD）,以3 倍SD值作为检出限（LOD），结果见表3。

2.3.4 重复性试验取牛黄样品（NH-1）粉末约0.2 g，共6 份，精密称定，按“2.2.3”项下方法进行消解，制备供试品溶液，测定，结果见表3。

2.3.5 加样回收率试验取牛黄样品（NH-4）粉末约0.1 g，共12 份。6 份加入26 种元素混合标准溶液（浓度：100 μg·mL-1）1 mL 和硝酸4 mL，作为Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn 9 种元素的加标回收样品；6 份加入26 种元素和汞元素混合溶液（浓度：0.5 μg·mL-1）1 mL 和硝酸4 mL，作为剩余18 种元素的加标回收样品，按“2.2.3”项下方法消解制备，以回收率溶液中待测元素响应值和内标元素响应值的比值，扣除试剂空白后，以线性回归方程算得各待测元素的含量，并计算加样回收率，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果（n=6）

2.4 测定结果

分别取各样品溶液，按“2.1”测量条件进样测定，每个样品测定3 次，取平均值，以线性回归方程计算相应元素的浓度，并计算样品含量。结果见表5。

表5 各种牛黄样品测定结果（mg·kg-1）

3 分析与讨论

3.1 3 类牛黄的元素种类

在27 种元素中，天然牛黄正品不含Be、Al、Ti、Cr、Ag、Sn 6 种元素；体外培育牛黄正品不含Mo、Ag、Tl、Pb4 种元素；人工牛黄不含Be、Mo、Ag、Sb、Tl、Pb 6 种元素。天然牛黄伪品（NH-2、5）所含元素种类与正品相似，伪品（NH-9、15）含所有的27 种元素；体外培育牛黄伪品（NH-8）只含有Na、Mg、Fe、Ca 等12 种元素，远少于正品。

3.2 测定结果的主成分分析

采用matlab 9.4 软件对测定结果进行主成分分析，见图1。从图1 看出，天然牛黄正品（NH-1、3、4、6、7）和人工牛黄（NH-12、13、14）大致聚集在一类；天然牛黄伪品（NH-2、5）与体外培育牛黄伪品（NH-8）在一类；体外培育牛黄正品（NH-10、11）在一类；天然牛黄伪品（NH-9）也独自成为一类。继续深入分析，通过载荷矩阵，得出第一主成分的值同Ca、Mg 正相关；第二主成分的值同Fe、Cu、Pb 正相关；第三主成分的值同Hg 正相关。

图1 牛黄主成分分析得分图

3.2.1 第一主成分钙、镁天然牛黄正品的钙元素含量在1100～1800mg·kg-1，镁元素含量在180～360mg·kg-1，钙/镁比值为4.8～6.8；伪品（NH-2、5）钙元素含量≥2800 mg·kg-1，镁元素含量≥370 mg·kg-1，钙/镁比值约为7.5，伪品（NH-9、15）钙元素含量≤250 mg·kg-1，钙/镁比值＜0.7。体外培育牛黄正品的钙元素含量在6600～7590 mg·kg-1，镁元素含量在730～980 mg·kg-1，钙/镁比值为7.7～9.1；伪品（NH-8）钙元素含量为193 mg·kg-1，显著低于正品中钙元素含量。人工牛黄钙元素含量在1900 mg·kg-1左右，镁元素含量在130～145 mg·kg-1，钙/镁比值为13.5～14.9。

研究天然牛黄形成机理，牛黄是牛的胆结石，是一种病理产物，其形成是一个复杂的病理生理过程。结石形成的重要因素是正常胆汁变为成黄性胆汁，胆汁中的游离胆红素含量升高，与胆汁中钙、镁等金属离子结合，生成胆红素钙盐沉淀，沉淀在胆汁中的粘蛋白的作用下，形成粒状物或块状物，这是牛黄的小颗粒[6]。所以天然牛黄中含有适量的钙、镁元素。文献资料显示[7]，体外培育牛黄，是在反应釜中模拟牛胆内的生物环境，取新鲜牛胆汁，加入去氧胆酸、复合胆红素钙等通过一系列生物制药工艺流程制成，故体外培育牛黄中钙、镁的含量非常高。

3.2.2 第二主成分铁、铜、铅天然牛黄正品中铁、铜元素含量差异较大，但铁/铜比值相对固定，在0.14～0.28；伪品的比值均＞0.3，在0.33～19.04。体外培育牛黄正品中铜元素含量在3.5～4.1 mg·kg-1，铁/铜比值在42～55，伪品中不含铜。人工牛黄铜元素含量为1.7～2.1 mg·kg-1，铁/铜比值在70 左右。铅的含量在天然牛黄中最高，其余两种牛黄中几乎不含。

3.2.3 第三主成分汞天然牛黄正品中汞元素含量均＜1.0 mg·kg-1，其余两种牛黄中含量均＞1.0 mg·kg-1。

3.3 其他元素的含量

体外培育牛黄中铝、铬、钛的含量最高，天然牛黄中几乎不含；天然牛黄中锰的含量较高，体外培育牛黄、人工牛黄中几乎不含或含量很少；体外培育牛黄中锶的含量最高，其次为人工牛黄。

4 小 结

本实验结果表明，天然牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄在元素种类上差别不大。通过主成分分析，27 种元素中以钙、镁、铁、铜、铅的含量差异最为显著，其中钙/镁比值、铁/铜比值可作为鉴别天然牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄及其相应伪品的重要参数。采用本实验的元素主成分分析法可以快速的分类3 种牛黄及其相应的伪品，为牛黄类药材及其伪品的元素鉴别提供了数据支持。