基于系统虚拟药理学与归经理论研究归大肠经中药抗结直肠癌药效物质基础*

洪盛威，夏泽远，陈 恒，王 皓

1 南京中医药大学鼓楼临床医学院，南京 210008；2 南京大学医学院附属鼓楼医院 药学部，南京210008

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床常见的癌症类型，其在全球的发病率与致死率均逐年升高。我国CRC 的发病率为284.55/10 万，死亡率为176.28/10 万[1]。目前其主要治疗手段是手术、化疗及放疗相结合的综合治疗，由于放化疗技术具有副作用明显、局部选择性差的缺点，故对药物治疗方法进行研究仍属热点。

现代肿瘤靶向制剂具有选择性高、作用效应好的优点，广泛应用于特定肿瘤的临床治疗中。中医归经理论表明，药物作用于机体有相对的趋向性，可发挥引导效应。现代药理研究表明，中药归经理论与现代肿瘤靶向制剂研究观点极为相似[2]。能否利用归经理论缩小抗CRC 药物的筛选范围，寻找具有抗CRC 作用的中药单体，值得深入研究探讨。

得益于X 衍射等相关解析技术的进步，CRC 疾病相关靶点结构逐步明晰，此类靶点受体结构的分子药物设计和药效物质基础研究得以迅速发展[3]。通过三维空间结构及能量匹配可预测药物（配体）和受体之间潜在的结合模式及结合力，探讨药物和靶点间作用效应机制。该方法降低了筛选活性成分的盲目性，缩短了筛选时间，降低了研发成本，为快速筛选中药潜在活性成分提供借鉴。

本实验基于CRC 发病机理[4]，针对性地选择归大肠经中药，从相关数据库及文献数据挖掘，构建该类中药的单体数据库；同时确定CRC 疾病相关靶点，借助于系统虚拟药理学方法探讨归大肠经中药单体与CRC 疾病相关靶点的结合效应，构建“活性成分-靶点-疾病” 作用效应图，并结合CCK-8 与Western blot 进行体外验证，为筛选中药潜在活性成分提供参考。

1 材 料

1.1 药物与试剂

黄连碱（批号MUST-17072010）、大黄酸（批号MUST-18031309）、芦荟大黄素（批号MUST-18032605）、大黄素（批号MUST-17102702）、杨梅素（批号MUST-18021524）、苦杏仁苷（批号MUST-18042810）均购自成都曼思特生物科技有限公司；DMEM 培养液（批号323050011），胎牛血清（批号085150010），青霉素、链霉素（批号450201008）均购自维森特生物技术南京有限公司；0.25%胰蛋白酶（批号67057313）Biosharp 公司；GAPDH 兔IgG（批号0019），VEGFR2 兔IgG（批号0002）均购自美国CST 中国分公司；MMP-9 兔IgG（美国Cell Signal公司，批号11927S）；蛋白预染Marker（Thermo，批号00261899）；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器

DMI3000B 倒置光学显微镜（德国莱卡公司）；MICRO-17R 冷冻离心机（美国Thermo 公司）；AE240 电子天平（美国梅特勒-托利多公司）；ELx800 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；EPS300电泳电源，VE-180 垂直电泳槽，5300 凝胶成像系统（均为上海天能科技有限公司）。

1.3 细胞培养

人结肠癌细胞HCT116 细胞购自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.4 中药单体的分子特征计算及计算机辅助筛选

分子特性计算基于Canvas 平台。计算机辅助筛选程序及软件为Maestro 药物设计平台，包括中药活性组分数据库中小分子前处理优化模块Macro-Model；活性组分基于靶点计算机辅助筛选模块Glide；蛋白三维结构的优化、评测模块同源模建Prime，用于蛋白靶点活性位点结合口袋搜寻及确证模块SiteMap。以上平台均来源于Schrödinger 公司。CRC 靶点选自GeneGo 公司系统虚拟药理学平台MetaDrug。

2 方 法

2.1 归大肠经中药单体数据库

收集常用中药[5]，获得大黄、乌梅、甘遂等归大肠经中药共85 味。基于传统中药系统药理学数据库（TCMSP）、中国中药整合数据库（TCMID），并结合相关文献数据挖掘，收集上述85 味归大肠经中药所含中药单体2925 个。从Pubchem 数据库中获得上述中药单体的分子结构、相对分子量、分子式等信息，建立归大肠经中药单体数据库。之后，使用MacroModel[6]模块对每个化合物进行处理，选择OPLS_2005 力场和TNCG 进行结构优化，优化时能量阈值设定为0.5 kJ·nm-1·mol-1，目的是使均方根偏差（RMSD）变化尽可能小[7]。

2.2 CRC 疾病相关靶点的选择

对CRC 相关信号通路领域的文献报道进行归纳总结[8]。采用GeneGo 公司MetaDrug 模块，选择CRC 靶点。通过对靶点相关的配体、蛋白信息的判别，最终确定了10 个与CRC 疾病相关的靶点。

2.3 中药单体分子特性计算及计算机辅助筛选

将2925 个归大肠经中药单体装载到Schrödinger（2018）平台的Canvas 模块，对9 个关键分子描述符进行计算，包括原子的LogP、电拓扑状态、氢键受体数、氢键供体数、摩尔折射率、分子量、极性表面积、Miller 极化值、可旋转键数，涉及物理化学、拓扑等多个方面的信息。根据相关数据库及文献报道，确定CRC 疾病相关靶点，其蛋白结构均从RSCD PDB 数据库获取，选用Maestro 药物设计平台的计算机辅助筛选模块Glide；本研究的筛选程序如下：将每个CRC 疾病相关靶点导入平台，进行加氢原子、去除水分子、处理重原子、调整键序等前处理，选用OPLS_2005 力场进行能量最小化优化处理，直到非氢原子的均平方根偏差（root-meansquare deviation，RMSD）减小为3 nm。接着，采用Glide 对接模块下receptor grid generation 面板产生活性位点结合口袋，以各个蛋白自带配体为中心、生成活性格点盒子；其中蛋白和配体间范围设置为1.0/0.8；精度方面选择标准精度，每个配体均对接10 次，最后取总平均值，进行归大肠经的中药单体基于CRC 靶点的计算机辅助筛选研究。最后，记录辅助筛选评价打分指标如对接得分、范德华力、结合能、氢键指标等，并按照总对接得分从高到低依次排序，以评价各中药单体与CRC 靶点间的结合效应。

2.4 “活性成分-靶点-疾病”网络构建与分析

依据计算机辅助筛选结果，以CRC 靶点蛋白自带配体的对接评分为阈值，得分高于阈值的中药单体即判定具有活性，选取前30 个成分与相应的靶蛋白导入Cytoscape3.7.1 网络分析软件，构建“活性成分-靶点-疾病”网络，其中单体、靶点、疾病用节点表示，三者间的相互关系用边表示，最后选用Cytoscape3.7.1 的Network Analyzer 插件分析“活性成分-靶点-疾病”网络特征。

2.5 HCT116 细胞的培养及分组

复苏HCT116 细胞株，当细胞长至80%亚融合状态时，弃去原培养液，PBS 荡洗2 次，胰酶消化，弃消化液，PBS 荡洗2 次，加适量含10%胎牛血清的DMEM 完全培养液，吹打成单个悬浮细胞，分成4 瓶，继续培养。用4～6 代HCT116 细胞、生长融合后，胰蛋白酶消化、吹打成单个悬浮细胞，用于后续实验。分组为：对照组、给药组（50 μg·mL-1）。药物用DMEM 培养液稀释，进行药物干预前，弃去原培养液。

2.6 CCK-8 法检测细胞活性

借助CCK-8 法检测筛选出的前6 个中药单体对HCT116 细胞活性的影响。悬浮细胞计数板计数，之后用DMEM 培养液稀释细胞，并将密度调整至1×105个·mL-1，将该浓度的细胞接种于96 孔板中，每孔100 μL，每组设置10 个复孔，共7 组，24 h细胞孵育贴壁后，弃去原培养液，各组加入对应药物100 μL，对照组加入DMEM 培养液100 μL，培养24 h，之后每孔加入CCK-8 试剂10 μL，继续培养4 h后，使用酶标仪在450 nm 波长处测定吸光值（OD）。将对照组细胞存活率定义为100%，细胞活性按公式计算：细胞活性=（试验组OD 值/对照组OD 值）l00%。

2.7 Western blot 检测VEGFR2、MMP-9 蛋白水平

为证明筛选策略的可靠性、准确性，本研究选取VEGFR2、MMP-9 进行Western blot 实验验 证，研究筛选结果中前6 个中药单体对HCT116 细胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表达的影响。计数板计数悬浮细胞，用DMEM 培养液稀释细胞，并将密度调整至2.5×105个·mL-1，将该浓度的细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，每组设3 个复孔，共7 组，24 h 细胞孵育贴壁后，弃去原培养液，各组加入对应药物2 mL，对照组加入DMEM 培养液2 mL，培养24 h 后，胰蛋白酶消化细胞，收集各组细胞至新的EP 管内。Western blot 裂解液冰上裂解细胞30 min，4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min，收集上清液，Bradford 法进行蛋白定量。加入上样缓冲液并煮沸蛋白10 min，取50 μg 总蛋白作SDS-PAGE 电泳，将蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，按照分子量的大小将PVDF 膜剪开，使内参GAPDH 与目的基因分开，之后分别孵育GAPDH（1∶5000）、VEGFR2（1∶1000）、MMP-9（1∶500）抗体，4 ℃孵育过夜，以TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min，之后以对应的二抗（1∶10000）孵育2 h，以TBST 清洗PVDF 膜3次，每次10 min，采用凝胶成像系统化学发光成像。

2.8 统计学处理

Western blot 数据采用Quatity one 软件进行灰度值的统计，计量数据以均数±标准差（）表示，数据结果采用GraphPad Prism 6.0 软件进行方差分析并作图。多组间的比较采用单因素方差分析，组间比较采用t 检验。P<0.05 为有统计学意义。

3 结果

3.1 归大肠经中药单体的分子特征

采用Canvas 模块对归大肠经的中药单体分子描述符进行计算，结果见表1。中药化学成分数量众多，结构类型各异。本研究共研究了85 味中药中共计2925 个单体，表1 显示，统计的描述符数据中极性表面积等指标SD 与均数相近，甚至大于均数，离散度大。该统计结果表明，本研究构建的归大肠经的中药单体数据库具有较好的结构多样性分子特征。

表1 归大肠经中药单体的关键描述符特征

3.2 靶点选择

通过对CRC 靶点网络进行系统研究分析，确证了10 个CRC 类疾病相关的作用靶点，分别为：基质金属蛋白酶3（MMP-3）、表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、甲状腺素转运蛋白（TTHY）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）、成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）、酪氨酸蛋白激酶ABL1（ABL1）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），详细信息见表2，并在此基础上考察中药单体与CRC 靶点间的作用效应。

表2 CRC 疾病相关靶点

3.3 与蛋白多靶点作用效果较好小分子化学结构

本研究筛选了2925 个中药单体与10 个CRC相关靶点之间的结合效应，限于篇幅，未能将每个单体与对应靶点的结构效应一一列出，仅选出与4个及以上靶点有作用效应的中药单体，共计30 个，见图1。筛选出的中药单体从结构上属于黄酮类、香豆素类、蒽醌类、木脂素类、苯甲酸类、糖苷类、酚类、脂肪酸类、生物碱类等化合物。对85 个归大肠经中药与30 个分子的相关性进行分析，排名前5的中药分别为：老鹳草（7/30）、马齿苋（6/30）、败酱草（6/30）、泽漆（6/30）、委陵菜（6/30），其中有7 个中药单体来自老鹳草，占较大权重（7/30），分别为（5）杨梅素、（11）鞣花酸、（17）金丝桃苷、（24）槲皮素、（25）芦丁、（26）山奈酚、（29）木犀草素。

图1 筛选出的前30 个中药单体的分子结构信息

表3 列举了与4 个及以上CRC 靶点存在较好结合效应的30 个中药单体，包括：（1）黄连碱、（2）大黄酸、（3）芦荟大黄素、（4）大黄素、（5）杨梅素、（6）苦杏仁苷、（7）千层纸素A、（8）咖啡酸、（9）巴豆酸、（10）大黄酚、（11）鞣花酸、（12）汉黄芩素、（13）丁香酸、（14）瑞枯灵、（15）辛夷脂素、（16）小檗碱、（17）金丝桃苷、（18）桧黄素、（19）丁香酚、（20）香豆素、（21）芹菜素、（22）香叶木素、（23）蒙花苷、（24）槲皮素、（25）芦丁、（26）山奈酚、（27）芫花素、（28）异鼠李素、（29）木犀草素、（30）大黄素甲醚。

表3 前30 个与CRC 靶点结合效应较好中药单体的多靶点效应

3.4 “活性成分-靶点-疾病”网络效应

以“活性成分-靶点-疾病”网络层次分析可以提供生物网络的一般特征，亦可计算节点的拓扑学特征，此方法有助于从复杂生物网络中获得潜在的生物信息。如图2 所示，“活性成分-靶点-疾病”网络表明，中药既存在单个成分与多个靶点的相互作用，同时也存在不同成分作用于同一个靶点的现象，该结果初步阐明了中药多成分多靶点的作用特点。通过Network Analyzer 插件计算网络模型的重要参数，常见的网络参数有节点数（number of nodes）、网络密度（network density）、网络异质性（network heterogeneity）、网络中心度（network centralization）等[9]。网络分析数据结果显示：直径为3，半径为2，中心度为0.530，密度为0.240，节点数为41，异质性为0.718。

图2 中药抗CRC“活性成分-靶点-疾病”网络特征效应图

3.5 筛选出的前6 个中药单体对HCT116 细胞活性的影响

由CCK-8 结果显示，与对照组相比，给予黄连碱、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、杨梅素、苦杏仁苷（50 μg·mL-1）后，各组细胞存活率显著降低（P<0.05），说明通过计算机辅助筛选出的前6 个中药单体对HCT116 细胞活性具有一定的抑制作用，其细胞活性（相比对照组）分别为100.00±6.23、69.11±8.12、82.33 ±5.23、75.23 ±6.25、78.55 ±4.63、71.66 ±6.65、83.79±7.78。

3.6 筛选出的前6 个中药单体对HCT116 细胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，与对照组比较，黄连碱、大黄素、杨梅素、苦杏仁苷组HCT116 细胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；大黄酸组HCT116 细胞中VEGFR2 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；芦荟大黄素组HCT116 细胞中MMP-9 蛋白表达水平显著降低（P<0.05），该结果表明，黄连碱、大黄素、杨梅素、苦杏仁苷可以同时抑制HCT116 细胞中MMP-9 和VEGFR2 蛋白的表达；大黄酸可以抑制HCT116 细胞中VEGFR2 蛋白的表达，芦荟大黄素可以抑制HCT116 细胞中MMP-9 蛋白的表达，结果见图3。以上结果与计算机辅助筛选结果完全一致，这在一定程度上验证了本策略的可靠性、准确性。

图3 HCT116 细胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表达水平

4 讨论

临床上多数疾病的发病机理较为复杂，涉及多基因、多靶点通路和网络调控。西药的开发基本是基于“一药物、一靶点、一疾病”的研发模式，该方法看重药物与靶点之间作用的特异性而忽略了人体各系统之间的平衡关系。虽然一些针对肿瘤分子遗传学改变开发的抗肿瘤新药已在临床使用，并显示出良好的临床应用前景；但其只针对部分特定类型的肿瘤患者才能发挥疗效，并存在一定的不良反应。中药是中医防病治病的主要手段，是天然组合化学库，化合物数量巨大。大量文献报道表明，许多中药复方、单味中药在CRC 治疗方面可发挥明显作用，同时具有副作用小、易于取材的优点[10]；但其作用机制及活性成分不明确的问题成为开发中药新药的瓶颈，如何从中药中筛选出活性成分对于中药的发展至关重要。

归经是指中药对某脏腑经络的选择特性，是中药药性理论的重要组成部分，中医归经理论的运用是中医学的特色之一，其实质是宏观的靶向思维。在中医药肿瘤治疗的临床实践中，已有学者总结了归经理论用于肿瘤中药治疗的经验，如脑肿瘤用虫类药僵蚕、全蝎；食管癌用硼砂、硇砂；甲状腺癌用白芥子、僵蚕；肺癌用桔梗、白果；胃癌用半枝莲、白术；肝癌用柴胡、青皮、陈皮；直肠癌用苦参等[11]。从归大肠经中药中寻找抗CRC 有效成分，可有效缩小抗癌药物的筛选范围，提高筛选的靶向性。系统虚拟药理学是利用分子对接技术研究小分子配体与生物大分子受体间的相互作用，预测其结合模式，进而实现基于结构的药物设计。基于配体与受体作用的锁匙原理，分子对接可较为准确地预测与靶受体活性部位空间和电性特征相匹配的小分子化合物，目前已在天然药物开发中被广泛使用。将系统虚拟药理学与归经理论用于中药新药的开发，探索一种中医归经理论指导下的，快速筛选中药活性成分的方法，对于研究中药药效物质基础及阐明其作用机制具有重要意义。

本研究将2925 个归大肠经中药单体与10 个CRC 相关靶点进行对接，筛选出其中与4 个及以上靶点有作用的中药单体，共计30 个，结构上属于黄酮类、香豆素类、蒽醌类等，其中除（9）巴豆酸、（14）瑞枯灵、（15）辛夷脂素、（17）金丝桃苷、（23）蒙花苷共5 个中药单体未见抗CRC 相关报道外，其余25个单体均有文献报道，其药理作用主要体现在抗增殖、诱导凋亡、诱导细胞周期阻滞、抑制血管生成和转移、抗氧化、抗炎以及化学防御等方面。研究筛选出的与30 个候选中药单体相关度最高的是归大肠经中药——老鹳草，具有抑制CRC 细胞增殖的药效，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关[12]。此后，为证明筛选策略的可靠性、准确性，借助CCK-8检测前6 个中药单体对HCT116 细胞活性的影响，并抽取VEGFR2、MMP-9 这两个靶点进行机制层面的验证，抽取VEGFR2、MMP-9 进行实验验证的原因如下：（1）本研究创新点在于探索一种中医归经理论指导下的、快速筛选归大肠经中药治疗CRC 活性成分的方法，进行靶点验证的目的是证明筛选策略的可靠性、准确性，即证实筛选出的成分确有抗肿瘤活性，并非为了发现新的靶点，故抽取了2 个靶点进行了初步验证；（2）本课题组前期做过VEGFR2、MMP-9 的相关研究[13，14]，方法较为成熟，因此对这两个靶点先进行初步验证。为进一步验证筛选出的30 个潜在活性成分的准确性，后期将继续对剩余8 个靶点进行验证，并深入探究活性成分的抗肿瘤机制。

本研究基于中医归经理论，应用系统虚拟药理学，建立一种快速、靶向明确的筛选中药活性成分新方法，初步阐明了归经理论在药物筛选中的指导价值，为快速筛选中药抗肿瘤活性成分研究提供新思路。研究筛选出的30 个候选活性化合物，后续可凭借药物化学手段进行结构修饰或改造，最终为单用或联合用药提供更多的药物来源。