银耳多糖抗B16 黑色素瘤肺转移的作用及机理研究*

苏巧玲，李秀敏

闽南师范大学 菌物产业工程技术中心，福建漳州363000

黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤[1]，由异常黑色素细胞过度增生引发的皮肤肿瘤，具有恶性程度高、死亡率高的特点，且发病率逐年上升，主要表现为皮肤色素痣的形态和颜色改变，容易发生侵袭转移，可发生骨转移、肺转移等[2]。相关研究显示，黑色素瘤目前的发病机制尚不明确，如果患者长时间在日光紫外线中暴露，会增加患黑色素瘤的风险[3]。黑色素瘤发病较为隐匿，并且转移时间早，容易复发，部分患者存在放、化疗抵抗，因此死亡率较高[4]。寻找高效低毒的天然产物对改善黑色素瘤的治疗是十分有意义的。

肿瘤转移是一个多环节、多因子参与的连续的、复杂的过程，经过不断增殖最终形成转移灶。与自发转移模型相比，将B16 黑色素瘤细胞注射到鼠尾静脉减少肿瘤发展的中间状态，因其可重复性和评估抗转移效果的时间经济性而被广泛应用于实验研究[3]。

银耳别名雪耳、白木耳等，从古至今素有“菌中之冠”的美誉，是我国广泛种植的一种可食用菌，营养价值高，具有较高的药用价值[5]。银耳多糖是银耳真菌子实体中最主要的生物活性成分，占银耳干重的70%～75%。研究证实，银耳多糖为杂多糖，其主链是由α-（1-3）-糖苷键组成的甘露聚糖，主链的2、4、6 位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及糖醛酸等残基组成的侧链，其活性中心为α-（1-3）-甘露聚糖[6]。其常见的功效有免疫调节、降糖降脂、抗氧化、抗衰老等[7-9]作用。本文旨在研究银耳多糖对黑色素瘤肺转移的影响，为进一步阐明银耳多糖抗黑色素瘤的机制提供一定实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

银耳多糖由本中心实验室依据银耳多糖的制备、鉴定与含量测定方法[10]提取获得；小鼠黑色素瘤细胞B16 购自于上海细胞库；ICR 小鼠，雄性，购自吴氏实验动物中心（生产质量合格证号：20180004027908）。

1.2 实验试剂及仪器

碳酸氢钠（A.R，广东西陇化工厂）；Dulbecco's Phosphate Buffered Saline（博士德）；DMEM 培养基（Gibco）；TRYPSIN 0.25%（1×）solution（HyClone）；胎牛血清（PAN BIOTECH）；TRIS（Amresco）；甘氨酸（BioFrox）；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）（博士德）；NC 膜（Whatman，protran）；宽范围彩色预染蛋白质Marker（天根）；CD206 抗体（abcam）；PPARγ抗体（CST）；β-Tubulin 抗体（Affinity）；PD-1 抗体（Abcam）；CD86 抗 体（Abcam）；Anti -rabbit IgG（RD）；30%Acr-Bis（29∶1）（博士德）；WesternBright ECL 化学发光底物（advansta），Annexin V-FITC/PI（meilunbio）。

电子分析天平（岛津，日本）；立式自动压力蒸汽灭菌器（ZEALWAY，美国）；超低温冰箱（Thermo Fisher，美国）；全波长酶标仪（TECAN，瑞士）；常温高速离心机5810 R（eppendorf，德国）；HF safe 生物安全柜（Heal Force）；低温高速离心机（BECKMAN，COULTER）；CO2培养箱（ESCO）；IX51 倒置显微镜（OLYMPUS）；MicroPublisherTM5.0 RTV 彩 色CCD摄像头（OLYMPUS）；多维全景流式细胞仪（Merck Millipore（amnis），德国）；激光共聚焦显微镜（Leica，TCS-SP8，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1 B16 黑色素瘤细胞培养常规培养B16 黑色素瘤细胞，加入DMEM 完全培养基（10%胎牛血清+1%链霉素-青霉素），用移液枪轻轻吹打重悬细胞团，调整细胞密度，以8 mL/皿的量接种于Φ100 mm细胞培养皿中，置于37 ℃、5%培养液的培养箱中，待其处于对数生长期将细胞传代，使细胞生长至70%～80%，分别设置空白对照组、1.25 mg·mL-1TFP 组、2.5 mg·mL-1TFP 组。动物实验前，弃去培养液，PBS洗净。加入0.25%胰酶消化液，轻吹培养皿使细胞脱落。用移液管吹打细胞，获得单细胞悬液。1000 r·min-1离心细胞5 min，用PBS 洗2 遍，计数调整细胞数至5×106个/mL。

1.3.2 流式细胞仪分析①细胞收集：用不含EDTA 的胰酶消化细胞并收集到离心管中，每样本细胞数为（1～5）×106/mL，2000 r·min-1离心3 min，弃去培养液；②用孵育缓冲液洗涤1 次，2000 r·min-1离心3 min；③用100 μL 的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min；④2000 r·min-1离心3 min 沉淀细胞孵育，缓冲液洗1 次；⑤加入荧光溶液，4 ℃下孵育20 min，避光并不时振动；⑥流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，CH02 检测FITC 荧光，CH05 检测PI；⑦结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（AnnexinV-FITC-/PI-）；左上象限是坏死细胞，为（AnnexinV-FITC-/PI+）；右下象限为早期凋亡细胞，显现（AnnexinV-FITC+/PI-），右上象限为晚期凋亡细胞，显示为（AnnexinV-FITC+/PI+）。

1.3.3 实验性肺转移小鼠模型的建立4 周龄ICR小鼠（SPF 级），雄性，于（20±2）℃饲养，相对湿度50%～60%，黑暗光周期12 h，小鼠可随意餐食以及饮水。

将小鼠随机分成3 组，每组8 只，具体实验方案如表1 所示。

表1 动物实验方案

接种后，每天观察肿瘤生长情况，连续观察20天后，断食、不断水过夜，第二天解剖完整分离成形肿瘤，观察肿瘤大体病理特征后，通过后续的蛋白质印记分析、HE 染色以及免疫荧光等观察肿瘤病理学特点，其中4 只小鼠用来进行WB 检测，4 只用来进行HE 染色和免疫荧光。

1.3.4 Western Blot 检测巨噬细胞分型及PPARγ表达将上述收集的肺组织加入RIPA 裂解液，用组织匀浆器匀浆1 min，冰浴振荡30 min 左右，于4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，收集上清液。

蛋白样品经浓度测定调成一致和变性后，根据所测目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度为10%分离胶；电泳后转膜，湿转法将蛋白转至NC 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。按1∶1000 稀释一抗，于4 ℃摇床孵育过夜。

经TBST 清洗后，以1∶5000 稀释二抗，室温孵育1 h，利用化学发光成像系统，对蛋白条带信号强度进行观察分析。

1.3.5 HE 染色①肿瘤组织脱水包埋后，切成4微米薄片,贴附于载玻片上，42 ℃烘箱过夜；②将切片置于烘箱中，60 ℃烘烤1 h；③脱蜡，梯度酒精复水；④脱蜡结束后，将切片浸泡在蒸馏水中，摇床上缓慢摇洗4 min，以洗净酒精；⑤苏木素染细胞核：苏木素染液染2 min，流水冲洗6 min；⑥1%的盐酸酒精分化后进行伊红染色：伊红染色3 min，流水冲洗6 min；⑦脱水封片：将切片依次放入70%、80%、95%乙醇溶液；无水乙醇溶液；乙醇∶二甲苯=1∶1 的混合液；二甲苯溶液后，晾干中性树胶封片；⑧使用显微镜观察，并在目镜10×，物镜20×下拍照。

1.3.6 免疫荧光染色检测巨噬细胞分型及PPARγ表达①～④石蜡切片脱蜡的过程同HE 染色；⑤抗原修复：将切片置于柠檬酸修复液中，微波炉中高火加热5 min；⑥将修复过的组织切片迅速放入预热的蒸馏水中，凉至室温，摇洗4 min，再换成PBS缓冲液摇洗2 次；⑦3% H2O2滴到切片上，湿盒中避光反应，以除去内源性过氧化氢酶；⑧加入0.1%tritonX-100 穿膜，室温穿膜10 min，PBS 摇洗3 次；⑨山羊血清封闭：山羊血清，室温封闭1 h，PBS 缓冲液摇洗5 次；⑩一抗孵育：切片滴加一抗（1∶100），置于湿盒内，4 ℃孵育过夜；11○二抗孵育：切片滴加荧光二抗（1∶200），室温避光孵育60 min；12○DAPI 染核：切片滴加DAPI 染液（1∶5000），避光室温孵育5 min；13○封片：切片滴加适量防荧光淬灭剂（40～50 μL/玻片），室温过夜封片；14○使用激光共聚焦显微镜观察，并在目镜10×，油镜63×下拍照；15○用Image J 统计分析CD86 荧光强度。

1.4 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 TFP 对B16 凋亡的影响

首先对各组细胞的凋亡情况进行检测，由图1可知，1.25 mg·mL-1的TFP 可上调B16 细胞的晚期凋亡细胞数，对早期凋亡和死亡细胞比例无明显影响；2.5 mg·mL-1的TFP 可上调B16 细胞晚期凋亡和死亡细胞数，对早期凋亡细胞比例无明显影响。

图1 流式细胞仪检测TFP 对B16 细胞凋亡的影响

2.2 TFP 抑制B16 肺转移结节的产生

图2A 为本实验的流程图。实验发现模型组与TFP 处理组相比体重变化趋势相似（图2B），无显著性差异。静脉注射20 天后，收集样本，肉眼观察发现，模型小鼠肺内布满黑色素肿瘤结节，且体积较大；而1.25 和2.5 mg·mL-1TFP 组小鼠肺内肿瘤结节转移明显少于模型组，有些甚至没有可见的肿瘤结节（图2C），表明TFP 可显著抑制B16 细胞转移作用。脏器湿重可以体现脏器损伤程度，脏器越重表明黑色素肿瘤转移越多。单因素方差分析各脏器重量显示，肺湿重3 组间有显著性差异（F（2，10）=4.309，P=0.049，P<0.05），两组间的多重比较采用LSD 事后分析。结果表明，与模型组比较，TFP 1.25 mg·mL-1和TFP 2.5 mg·mL-1组肺湿重显著降低（P=0.046，P<0.05；P=0.024，P<0.05）。而其它脏器湿重间无显著性差异。这些结果表明，不同剂量TFP 给药后的B16 黑色素瘤细胞转移能力下降，在一定程度上降低肺损伤。

图2 TFP 抑制小鼠黑色素瘤的肺转移结节的发生发展（n=8）

2.3 HE 染色检测肺组织病理情况

如图3 所示，肺组织HE 染色结果显示，模型组肺组织切片中有较大范围的黑色素瘤细胞沉积（红色箭头所示），肺泡结构被破坏，正常肺泡数目显著减少；TFP 1.25 mg·mL-1和TFP 2.5 mg·mL-1组肺组织切片基本呈现正常的肺泡结构，并且没有明显的黑色素瘤细胞沉积。

2.4 TFP 对巨噬细胞分型的影响

如图4A 所示，TFP 1.25mg·mL-1和TFP 2.5mg·mL-1组与模型组相比，CD206（巨噬细胞Ⅱ型标志）表达有显著上调趋势；免疫荧光图4B 的结果显示，TFP 1.25 mg·mL-1组和TFP 2.5 mg·mL-1组与模型组相比，CD86（巨噬细胞Ⅰ型标志）表达有明显上调趋势。这些结果表明，经TFP 作用后的B16 细胞转移至肺后，可刺激小鼠肺泡巨噬细胞向转移瘤处募集，CD86 和CD206 的表达均显著上调；而对CD86的上调显著强于对CD206 的上调（图4A、4C），表明对M1 型和M2 型巨噬细胞的招募差异，并且以M1型巨噬细胞为主，M1 型巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能。

图4 TFP 促进M1 型巨噬细胞浸润（n=4）

PD1 是免疫球蛋白B7 家族的成员之一，常表达于T 细胞、B 细胞、自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞的细胞膜，也表达于肿瘤细胞。模型组中PD1 的表达不完全与CD86 共定位，不共定位的PD1 上调表明模型组的B16 黑色素瘤细胞表达PD1。TFP 1.25 mg·mL-1组和TF P2.5 mg·mL-1组与模型组相比，PD1 表达与CD86 有较好的共定位且呈上调趋势，表明TFP 作用后的B16 细胞有招募I 型巨噬细胞的作用；但基本不存在不与CD86 共定位的PD1，表明TFP 抑制PD1 在肿瘤细胞上的表达。以上结果说明TFP 通过下调肿瘤细胞的PD1，抑制与PDL1 的结合，从而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。以上结果说明，TFP 可促进巨噬细胞浸润，且以I 型巨噬细胞为主。

2.5 TFP 对PPARγ 蛋白的调节作用

PPAR 是一种配体依赖的转录子，其功能广泛，可分为PPARα、PPARδ、PPARγ 3个亚群，其中PPARα、PPARγ 与炎症反应关系十分密切，在人和小鼠单核巨噬细胞中广泛表达，并抑制巨噬细胞内促炎基因的表达。PPAR 被认为具有阻止巨噬细胞向M1 型极化的作用；PPARγ 的表达能被IL-4 及IL-13 诱导，这提示PPAR 参与M2 的极化过程，PPAR 可以与PPARγ 辅助活化因子1β 共同作用直接调节M2 型标志物Arg1 的表达水平，使用巨噬细胞敲除PPARγ 的小鼠，发现PPARγ 对于M2 型巨噬细胞的成熟是不可或缺的。

如图5A 所示，WB 检测结果显示TFP 1.25 mg·mL-1组和TFP 2.5 mg·mL-1组PPARγ 蛋白有下调趋势，并且与模型组相比，有显著性差异。

如图5B 所示，模型组肺切片中PPARγ 蛋白的表达呈上调趋势，且部分PPARγ 蛋白染色与核染色重叠，表明部分PPARγ 蛋白有入核，处于激活状态；而TFP 1.25 mg·mL-1组和TFP 2.5 mg·mL-1组PPARγ 蛋白有明显下调趋势，且PPARγ 蛋白入核比较少，说明PPARγ 蛋白处于失活状态。

图5 TFP 下调PPARγ 的表达（n=4）

经TFP 作用后的B16 细胞，下调PPARγ 的表达，并使之处于失活状态，招募巨噬细胞到达肿瘤细胞聚集的部位；而模型组上调并激活PPARγ，发挥抗炎作用，表现为巨噬细胞较少被招募在肿瘤细胞聚集的部位，肿瘤细胞不断增殖分裂，从而影响正常肺功能。

3 结论

免疫和炎症构成肿瘤微环境的基本特征。肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞是巨噬细胞，在体内不同微环境的影响下，可极化为M1 型、M2 型巨噬细胞。M1 型巨噬细胞吞噬和抗原提呈能力较强，也可直接吞噬和杀伤病原微生物和肿瘤细胞，并分泌促炎细胞因子和趋化因子，参与免疫应答，发挥免疫监视的功能；M2 型巨噬细胞抗原提呈能力较低，并通过分泌抑制性细胞因子，下调免疫应答，介导肿瘤的免疫逃逸，在肿瘤的发展、浸润和转移过程中发挥重要作用。

本研究的模型设计是介于预防治疗和接种后治疗的一种方法，用于检测肿瘤细胞在动物体内分化以及对肿瘤微环境中免疫细胞的影响。这种方法是细胞实验的延续，把细胞实验和体内肿瘤微环境变化联系在一起，可观察肿瘤细胞在体内的进一步发展，以及该变化对免疫细胞的影响。这种方法可用于药物前期筛选，具有一定的创新性和可行性。

综上所述，银耳多糖能显著下调B16 小鼠黑色素瘤细胞中PPARγ 的表达并抑制其活性，招募巨噬细胞到小鼠肺组织，并以M1 型的巨噬细胞浸润为主，M1 型巨噬细胞可分泌大量促炎物质，从而发挥炎症反应和免疫防御作用。