致病疫霉木瓜蛋白酶亚家族基因C1A-PH-SCH1的克隆与表达分析

刘 霞，张 哲，钱红洁，张利杰，杨艳丽

（1云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2云南省植物病理重点实验室，昆明 650201）

0 引言

马铃薯晚疫病是马铃薯生产的主要病害之一，每年都有不同程度的发生和流行，已成为制约马铃薯产业发展的因素[1]。近几年来，全球每年因致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病所造成的损失不可估量[2]，而云南省是中国马铃薯主产地之一，其致病疫霉菌具有多样性、致病性强等特点。目前对马铃薯晚疫病菌的致病机理也未完全了解，基于此，探索由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病致病机制，为以后防治晚疫病奠定基础。半胱氨酸蛋白酶是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸并受巯基反应基不可逆抑制的蛋白水解酶，广泛存在于人类、哺乳动物、植物、原生动物、真菌、细菌、病毒等生物体内，共有49个家族[3]。植物中大部分属于木瓜蛋白酶亚家族和豆类天冬氨酸蛋白内切酶亚家族，还有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶亚家族和钙依赖半胱氨酸蛋白酶亚家族，之后还发现催化蛋白去泛素化的泛素类半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶体[4-5]。半胱氨酸蛋白酶参与植物中某些细胞沉积和降解贮存蛋白，非生物胁迫和生物胁迫的响应，启动子中常含有胁迫响应元件，但在马铃薯(Solanumtuberosum)中发现tdi-65只受干旱诱导，而不受ABA诱导[6]。半胱氨酸蛋白酶是植物体重要的蛋白水解酶[4,7]，广泛参与对生物和非生物胁迫的响应[8]、参与植物体的衰老和细胞程序性死亡[9-10]、贮存蛋白的沉积和降解[11-12]等生理过程。半胱氨酸蛋白酶也参与植物生物节律的调节，近年来发现可能具有转录因子的作用。木瓜蛋白酶(Papain-like cysteine proteases,PLCPs)是C1A家族蛋白酶，是其中最具代表性、研究最为广泛深入的一种蛋白酶[13]。最初是在木瓜的乳汁和果实中得到的4类木瓜蛋白酶，随后在病毒、细菌、原生动物、真菌、动物和植物中被发现。这类蛋白酶在酸性pH条件下发挥活性。在植物半胱氨酸蛋白酶中，papain蛋白酶研究较多。其中拟南芥发现有32个编码papain型的半胱氨酸蛋白酶，主要分为：aleurain型、KDEL型、类actinidain型、类菠萝蛋白酶型、末端序列型、类组织蛋白酶B型、受衰老和逆境诱导型[14]。在酶前体会形成α螺旋和β折叠结构域，结构域之间会构成裂隙，裂隙底部为催化活性位点[15]，在保守区内其4个催化活性位点分别是Gln-Cys-His-Asn/Asp[16-17]，这也是papain蛋白酶的结构特点。酶前体分为2种，一种有EX3RX3FX2NX3IX3N(ERFNIN)花式，另一种无花式，还有的成员N端酶前体序列中含有液泡靶向信号NPIR，papain型绕过高尔基体而与蛋白贮存液泡直接融合[18]。据不完全统计，目前已发表超过50个类papain植物蛋白酶，对甜荞半胱氨酸蛋白酶基因研究发现，该基因能被干旱、高盐、ABA和衰老胁迫诱导[19]，但在致病疫霉中未见报道。实验室前期研究以云南省致病疫霉菌不同生理小种的3个菌种为试验材料，通过提取纯化3个致病疫霉菌的代谢产物，进行双向电泳检测，用液质联用质谱分析，得到了3个菌种共有的16个蛋白[20]。本试验对其中假定能引起毒害的登录号为gi|262108704的半胱氨酸蛋白酶家族基因进行克隆及基因功能分析，对原核表达产物活性进行测定，并明确原核表达蛋白能否引起马铃薯叶片的坏死，确定该蛋白是否参与马铃薯晚疫病的侵染。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 马铃薯品种 供试马铃薯品种为‘大西洋’，植株不抗晚疫病。

1.1.2 病菌样本 本研究使用的病菌样本为XH05-5-4，其生理小种为2.4.8.9.10，由云南农业大学马铃薯研究室保存提供。

1.1.3 分子生物学试剂 反转录试剂盒TransScript®II Frist-Stand cDNA Synthesis SuperMix、克隆载体pEASY®-T1Cloning Kit、原核表达载体pEASY®-E1Expression Kit均购自北京全式金生物公司，切胶回收试剂盒TARAKA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0购自大连宝生物工程公司，高纯度质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 半胱氨酸蛋白酶家族C1A基因克隆ZH05-5-4菌株总RNA按照Trizol试剂说明进行，反转录按照试剂盒说明书进行。以蛋白编号为gi|262108704（登录号NW_003303706）的核苷酸序列为模版，利用Primer5.0软件设计引物F(5’-TGTTCAAGGCTGAGGGTG-3’)、R(5’-AGTTGGCTACATTCCATTCG-3’)，PCR反应条件 为 94℃ 变性 7 min，94℃ 40 s，57.4℃ 40 s，72℃1 min，35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物回收按照试剂盒进行，并连接到pEASY®-T1载体上，转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，经氨苄青霉素、X-gel筛选，随机选取独立的阳性克隆子，用通用引物做菌落PCR检测，并送上海华大基因公司测序鉴定，对样品进行备份。

1.2.2 序列分析 用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)程序预测等电点及分子量；NetNGlyc Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)工具预测氨基酸序列中可能存在的糖基化位点[20-21]；ProtScale预测不同肽段的亲水性疏水性变化 ；NPS@（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）对蛋白质二级结构进行预测[22]；用TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0)工具预测蛋白质跨膜结构,SingalP预测信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[20]。

1.2.3 原核表达 将反转录cDNA的切胶回收产物和pEASY®-E1Expression Kit进行连接，转化到感受态细胞Trans1-T1，经抗性筛选后挑取阳性单克隆子，接种至含Amp抗性的LB培养基中，培养至A600为0.5～0.8时提取质粒，导入BL21中，菌落PCR检测，取1 mL作为未诱导的阴性对照，同时建立空载体对照，向剩余培养液加入IPTG（终质量浓度为1 mg），37℃、220 r/min分别诱导2、4、6、12 h后各取菌液1 mL，离心10 min收集菌体，加入1 mL SDS凝胶加样缓冲液重悬，沸水浴，取上清液SDS-PAGE检测表达产物诱导情况，将诱导后的样品离心后重溶于PBS缓冲液，超声波破碎，再离心后留上清液备用。将菌液接种马铃薯品种‘大西洋’离体叶片，以无菌水和空载体作为对照组，对蛋白生物活性进行测定。

2 结果与分析

2.1 半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因克隆

2.1.1 PCR扩增产物 用1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到长约1000 bp的cDNA片段，切胶回收后连接克隆载体pEASY®-T1后进行菌落PCR检测，获得目的片段（图1）。片段长度为1176 bp，最大的开放阅读框1077 bp（图2），编码387个氨基酸。蛋白相对分子量41.671 kD，等电点4.88，说明蛋白呈酸性，该基因含Ser(S)最多，占10.0%，不含Asx(B)、Glx(Z)、Xaa(X)。总的带正电点残基(Arg+Lys)为29，负电残基(Arg+Glu)为41，其脂溶指数为75.77，不稳定系数41.91，为不稳定蛋白。

图1 PCR扩增图谱M:DNA marker(DL2000);1:目的片段

图2 半胱氨酸蛋白酶基因最大ORF核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

2.1.2 同源性分析 经BLAST分析，半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因核苷酸编码区序列与Genbank登录号为XP_002896821.1的核苷酸序列同源性为99%，与登录号为XM_008906598.1的核苷酸同源性为86%，与登录号为XM_004348520.1的核苷酸同源性为90%。对半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因的氨基酸序列进行BlastP分析发现其在保守区域与其他半胱氨酸蛋白酶具有较高的相似性，其中与PhytophthorainfestansT30-4 cysteine protease familyC01A同源性最高，利用SMART在线工具对蛋白质的结构域进行预测，发现C1A-PH-SCH1编码的氨基酸在143～357位具有Pept-C1结构域，可推断C1A-PH-SCH1属于木瓜蛋白酶亚家族。

2.2 生物学信息学分析

2.2.1 信号肽预测 利用SingaIP进行信号肽预测显示，蛋白第1～18个氨基酸残基为其信号肽（图3），信号肽的裂解位点在第18位的丙氨酸。

图3 信号肽预测

2.2.2 糖基化位点分析 利用NetNGlyc 1.0 Server预测其在第138、283位含有N-糖基化位点。

2.2.3 亲水性疏水性分析 利用ProtScale预测不同肽段的亲水性疏水性变化，结果表明：第5～23位的氨基酸均为疏水性，而第8、9位的亮氨酸(L)疏水性最强，第287位的Gln(Q)亲水性最强，但亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整个蛋白可能表现亲水性（图4）。

图4 亲水性/疏水性预测结构

2.2.4 跨膜结构预测 TMHMM2.0预测该蛋白有跨膜螺旋结构，具有跨膜结构（图5）。

图5 跨膜螺旋结构预测

2.2.5 蛋白二级结构预测 通过NPS@对基因进行蛋白质二级结构预测，结果显示：α-螺旋(H)含量为28.21%；无规则卷曲(C)含量为41.62%；而β转角(T)含量仅为9.78%；延伸链€含量为20.39%（图6）。

图6 二级结构

2.3 原核表达载体的检测

目的片段与表达载体pEASY®-E1连接后导入T1感受态中，经涂板挑取阳性菌导入BL21后，经终浓度为1 mmol/L IPTG，37℃下分别诱导2、4、6、12 h重组蛋白的表达，诱导完成后收集菌丝，对上清进行SDSPAGE电泳检测（图7），以空载体和没有经IPTG诱导的菌液蛋白做对照，结果表明，在诱导6 h后，发现41.67 kDa有1条明显条带，对照组不明显，表明外源蛋白在大肠杆菌中得到表达，原核表达载体构建成功。

图7 IPTG诱导大肠杆菌表达C1A-PH-SCH1重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果

2.4 外源表达蛋白生物活性测定

将原核表达的蛋白稀释成3个浓度接种马铃薯品种‘大西洋’的离体叶片，1周后供试叶片出现与晚疫病症状类似的坏死斑，对照组正常（图8）。因此可以推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。

图8 生物活性测定

3 讨论

木瓜蛋白酶参与了植物对逆境的反应[20,21,24]，植物衰老[22,25]及植物细胞程序化死亡[23,26]，Lee等发现OsCP1基因参与水稻雄性不育过程[24,27]；zhang等[25,28]在烟草花药中反义抑制NtCP56的表达，导致烟草花粉粒败育；严秀蕊等从水稻中克隆了OsCP2基因[26,29]；王高峰在马铃薯腐烂茎线虫中克隆了L型半胱氨酸蛋白酶[27,30]；张晓梅等发现NtCP56在反义RNA介导的转基因烟草花药中绒毡层的降解延迟从而导致花粉发育异常[25,28]；赵冬梅等报道PcFiSCR.1对马铃薯和烟草叶片有毒害作用，而PcFiSCR.1富含小的半胱氨酸的分泌蛋白，含有保守的半胱氨酸序列和N-末端信号肽[28,31]，还有大量报道称半胱氨酸蛋白酶家族是植物的凋亡或编程性细胞死亡的效应器等，在植物中半胱氨酸蛋白酶能引起植物的坏死，但在致病疫霉菌中未见有相关报道。所以本试验对致病疫霉中的分泌蛋白进行了生物活性测定，重组蛋白诱导表达结果显示当pEASYE1在BL21 DE3中表达，得到了很好的表达，在未诱导、诱导2、4 h均未看见有明显的条带，在6、8、12 h处蛋白出现大量的表达。本研究对木瓜蛋白酶进行生物活性测定的结果显示，叶片出现水渍状坏死斑的症状，而空载体、无菌水均未出现坏死症状，所以初步判断半胱氨酸蛋白酶家族对马铃薯有毒害作用，推测C1APH-SCH1参与了致病疫霉引起马铃薯晚疫病的过程。本试验采用原核表达系统，对于初步筛选蛋白毒性具有培养条件简单、基因操作容易、从构建到产物纯化周期短、成本低、产量高等特点。为后续对毒性蛋白进行基因定位，致病机理研究等工作奠定基础。

4 结论

本试验利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1），编码387个氨基酸。通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因，成功构建了原核表达载体，并使其在大肠杆菌中得到了表达，对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状，推测C1A-PHSCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。

生物学信息分析表明该蛋白为分泌蛋白，并且该蛋白存在一个N-糖基化位点，表明该蛋白翻译产生信号肽，当转译进行到第18位氨基酸之后，与信号肽识别体(SRP)识别并牵引至内质网进行糖基化修饰。通过进化树分析，发现C1A-PH-SCH1与致病疫霉菌半胱氨酸蛋白酶家族-木瓜蛋白酶亚家族在进化树上同源性最高，以及在SMART的蛋白功能结构域预测显示C1A-PH-SCH1拥有Pept-C1结构域，在保守区域内也具有木瓜蛋白酶亚家族共有的活性位点Gln-Cys-His-Asn/Asp。因此，可推断C1A-PH-SCH1属于木瓜蛋白酶亚家族。