葵花籽蛋白脱色工艺优化及功能特性研究

秦那日苏 包小兰

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018)

葵花籽是世界上四大主要油料种子之一[1]。葵花籽粕是葵花籽制油后的副产物，营养物质丰富，其蛋白质质量分数达29%～43%[2]，抗营养化合物含量低且不含有毒物质，因此是一种极好的蛋白质来源[3]。然而，葵花籽蛋白的应用仍然局限于动物饲料，尽管葵花籽蛋白的功能特性被证明与大豆和其他豆类的蛋白相当[4]。一个主要的原因是葵花籽中含有酚类化合物，它们很容易在传统的碱性蛋白质提取过程中被氧化导致蛋白质变成墨绿色或灰色，不仅颜色很难让消费者接受，而且还会降低蛋白的营养价值和功能特性[5，6]。

目前国内外对葵花籽蛋白的脱色方法主要有活性炭吸附法[7，8]、有机溶剂萃取法[9]、双氧水氧化法[10，11]及大孔树脂吸附法[12]。大孔树脂吸附法具有选择性好、吸附容量大、树脂易再生、环保及蛋白损失率低等优点[13]。Pickardt等[5]在酸性条件下通过XAD-16 大孔树脂吸附来提取低多酚葵花籽蛋白，发现大孔树脂吸附处理后脱色效果显著，其白度值(L*)为77.3，而且功能性质也有所提高。为了提升植物蛋白的营养价值和功能性质，目前多数通过酶法改性来实现，酶解能够正向修饰蛋白质，可以破坏特定的肽键，从而改变蛋白质的结构，酶解法的优点是pH和温度条件温和、反应副产物少、特异性高，易控制，安全等优点，从而改善蛋白质的提取率和功能性质。近年来，人们通过酶解结合吸附剂来提取植物蛋白或多糖，发现这个方法不仅可以提高功能性质，还对脱色效果具有显著的影响。邹东恢[14]使用纤维素酶和木瓜蛋白酶的混合酶结合活性炭吸附来提取枸杞多糖，发现提取出来的枸杞多糖脱色效果显著，脱色率为72.4%。张晓平等[15]利用碱性蛋白酶结合YD-303活性炭吸附来提取脱色燕麦蛋白，发现在最佳工艺条件下燕麦蛋白的脱色率高达85.36%。

本研究旨在通过限制性酶解后再结合大孔树脂进行吸附处理来提取葵花籽蛋白，促进葵花籽粕在人体营养方面的应用，同时分离出酚类化合物的来提高整个工艺的经济性，以期获得感官特性和功能特性都较好的葵花籽蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂葵花籽粕;AB-8、DA01和DA201型大孔树脂;碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、风味蛋白酶(Flavourzyme500 MG)、中性蛋白酶(Neutrase 1.5MG);所用化学试剂均为分析纯，用蒸馏水制备所有溶液。

1.2 仪器与设备

LCJ-25C型冷冻干燥机，CR-10型色差计，K116型凯氏定氮仪，UV-2300型紫外分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽蛋白的制备

称取低温脱脂葵花籽粉50 g，加500 mL无水乙醇1∶10 (g/mL)混合搅拌均匀，在25 ℃恒温水浴锅中搅拌1 h，离心(4 000 r/min，15 min)，取沉淀加750 mL (15倍)蒸馏水搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH调节pH 7.0，在50 ℃恒温水浴锅中搅拌1 h，离心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，用0.1 mol/L HCl调pH至4.0进行蛋白酸沉，离心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，沉淀水洗3次，收集沉淀用0.1 mol/L NaOH调pH至7.0，冷冻干燥保存备用。

1.3.2 大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的制备

称取低温脱脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化钠溶液(1∶10，g/mL)混合搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒温水浴锅中搅拌1h，离心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔树脂进行吸附(10%大孔树脂，120 min)，过滤树脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl调节pH至3.8酸沉，离心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸馏水将沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至7.0，冷冻干燥保存备用。

1.3.3 限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的制备

称取低温脱脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化钠溶液(1∶10，g/mL)混合搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒温水浴锅中搅拌1 h，离心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，加碱性、中性和风味蛋白酶限制性酶解10 min (1%酶添加量，最适酶解 pH和温度)，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔树脂进行吸附(10%大孔树脂，120 min)，过滤树脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl调节pH至3.8酸沉，离心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸馏水将沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至7.0，冷冻干燥保存备用。

1.3.4 葵花籽蛋白色泽的测定

采用CR-10色差仪进行葵花籽蛋白色泽的测定，首先进行黑白板自动校正，自动校正完成后进入标准测量界面，按测试键，读出标准样的L*、a*、b*值，进行样品色泽的测定(取3次平均值)。

1.3.5 葵花籽蛋白得率及含量的测定

含量与得率的测定:蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。

式中:m1为提取蛋白质质量/g；m0为葵花籽粕粉质量/g。

1.3.6 单因素实验设计

以L*值作为评价指标，分别对pH(5、6、7、8、9)，加酶量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、酶解时间(0、5、10、15、20 min)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)进行单因素实验，以确定各因素的适宜范围和影响效果。

1.3.7 正交优化实验

在单因素实验的基础上，选择酶解温度、酶解pH、酶解时间、酶添加量为影响因素，固定料液比为1∶10(g/mL)，pH为6.0，使用色差计测定葵花籽蛋白的白度值(L*值)，以葵花籽蛋白质白度值(L*)为评价指标进行正交工艺参数优化实验，并确定四因素三水平的最佳参数进行正交设计分析，实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.4 溶解性的测定

根据Bera等[16]的方法并稍作修改测定葵花籽蛋白的溶解度，用蒸馏水配制1 g/mL的蛋白样品溶液，用0.1 mol/L HCl或NaOH调pH为7，室温搅拌1 h后，离心(4 000 r/min，15 min),利用凯式定氮仪测定蛋白质含量。通过公式计算：

1.5 起泡性及泡沫稳定性的测定

参照 Motoi等[17]的方法并做一定调整，用蒸馏水配制1 g/mL的蛋白质样品溶液。取50 mL置于高速组织搅拌机内，以12 000 r/min的转速搅打2 min。记录泡沫体积，静置30 min后，再次记录泡沫体积。起泡性(FC)及泡沫稳定性(FS)通过公式计算：

式中:V0是搅打刚停止时泡沫体积/mL；VL是样品溶液体积/mL；V30是静置30 min后的泡沫体积/mL。

1.6 乳化性及乳化稳定性的测定

用Yust等[18]的方法来测定乳化性及乳化稳定性，用蒸馏水配制浓度为1 mg/mL的蛋白样品溶液，将15 mL蛋白质溶液与5 mL大豆油(3∶1)搅拌混合，在12 000 r/min的条件下均质2 min，分别在0 min (A0)和静置10 min (A10)后从容器底部取50 μL乳浊液，与5 mL(0.1%，g/mL)的SDS溶液混合均匀，用紫外分光光度计在波长500 nm处测定吸光度值。使用公式计算乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)：

式中:Φ为0.01；θ为溶液中油的体积分数(0.25)；C为样品的溶液质量浓度/g/mL。

1.7 持油性及持水性的测定

根据Wani等[19]方法测定持油性及持水性，称取0.5 g 样品(m0)置于 50 mL 离心管中，称重(m1)，加入10 mL大豆油(水)，漩涡振动 5 min使其混合均匀，室温下静置30 min后，4 000 r/min离心30 min，移除上清大豆油(水)，再称重(m2)。持油性/持水性(mL/g)计算公式为：

持油性/持水性=(m2-m1)/m0×100

式中:m0为蛋白质量/g；m1为离心管质量/g；m2为去掉上清液后的离心管质量/g。

1.8 数据处理

实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，试验数据采用SPSS 16.0统计软件里的方差分析(ANOVA) 进行两组间的数据分析，P<0.05表示两组之间具有显著性差异，采用 Origin 2017作图。

2 结果与分析

2.1 不同类型蛋白酶结合大孔树脂吸附对葵花籽蛋白脱色效果的影响

选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶限制性酶解10 min(最适pH及温度)结合D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂及DA201型大孔树脂(10%大孔树脂，吸附120 min)吸附处理对葵花籽蛋白脱色效果的影响，不同类型蛋白酶结合大孔树脂吸附对葵花籽蛋白脱色效果的影响见表2。

表2 不同类型蛋白酶结合大孔树脂吸附对葵花籽蛋白脱色效果的影响

由表2可知，未脱色葵花籽蛋白白度值(L*)为55.7，呈深灰色；经不同类型的大孔树脂吸附处理后脱色效果显著，蛋白颜色均有不同程度的改善，其中AB-8型大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的L*值最高，为72.2，先通过不同蛋白酶进行限制性酶解再结合大孔树脂吸附处理后发现具有更好的脱色效果，碱性蛋白酶限制性酶解后再结合AB-8型大孔树脂的吸附处理的脱色效果最好，其白度值最高为80.8，与其他蛋白酶和大孔树脂相比具有显著性差异(P<0.05)，表明限制性酶解后再结合大孔树脂吸附对葵花籽蛋白脱色效果具有显著的影响。因此选用碱性蛋白酶限制性酶解结合AB-8型大孔树脂处理进行下一步工艺优化实验。

2.2 单因素条件对葵花籽蛋白脱色效果的影响

2.2.1 酶解温度对葵花籽蛋白脱色效果的影响

在pH为7.0、酶解时间为10 min和酶添加量为1.0%的固定条件下，改变酶解温度分别为40、45、50、55、60 ℃，探讨酶解温度对葵花籽蛋白脱色效果的影响，其结果如图1所示。酶解温度从40 ℃升高至50 ℃过程中，葵花籽蛋白L*值呈现先下降后上升的趋势，在酶解温度为50 ℃时白度值L*达到最高，这是由于适宜的温度可以增加蛋白质在水中的溶解度，而且温度的升高在一定程度上有利于大孔树脂的吸附作用，从而促使葵花籽蛋白的白度值(L*)升高。随着酶解温度的升高，蛋白白度值发生骤降，这是由于蛋白质对温度敏感，过高的温度可使其发生变性，继续升高温度不利于酶作用的最适条件以及蛋白凝胶的稳定性，故选择酶解温度为50 ℃。

图1 不同处理对葵花籽蛋白脱色效果的影响

2.2.2 酶解pH对葵花籽分离蛋白脱色效果的影响

在酶解温度为50 ℃、酶解时间为10 min和酶添加量为1.0%的固定条件下，改变pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，探讨pH对葵花籽蛋白脱色效果的影响，其结果如图1所示。在pH 5.0～6.0之间，葵花籽粕蛋白质白度值(L*)不断提高，因此一定的pH值有利于葵花好柏蛋白质提取，在其他条件保持不变的情况下，在酶解 pH为6.0的时候葵花籽蛋白的白度值(L*)达到最高，但随着pH的增大，葵花籽蛋白质的L*值开始持续下降，脱色效果降低，因为当pH接处于等电点附近时，溶液中存在大量蛋白颗粒，不利于蛋白酶作用；当pH远离等电点时，葵花蛋白分子所带有的同种电荷量增多，分子间的主要作用力为静电排斥力，而蛋白质被酶解后，会暴露出部分疏水基团，其与静电斥力产生相互吸引。当pH为6.0时白度值L*达到最大值，说明在此条件下，大孔树脂对蛋白的吸附作用最为适宜，故选择pH为6.0。

2.2.3 酶解时间对葵花籽蛋白脱色效果的影响

在酶解温度为50 ℃、pH为7.0和酶添加量为1.0%的固定条件下，改变酶解时间分别为0、5、10、15、20 min，探讨酶解时间对葵花籽蛋白脱色效果的影响，其结果如图1所示。酶解时间对葵花籽蛋白的L*值的影响显著，酶解时间从0～10 min过程中，随酶解时间的延长葵花籽蛋白的L*值由72.2提高至80.9，提高幅度较大，10 min之后，葵花籽蛋白的L*值随时间的延长呈下降趋势，分析原因认为，利用限制性酶解葵花籽蛋白打断部分肽键，暴露出适量的疏水性氨基酸残基，从而提供大孔树脂更深层次的吸附，但若水解过度则会将蛋白质降解为短肽，不利于大孔树脂的吸附作用，故选择酶解时间为10 min。

2.2.4 加酶量对葵花籽蛋白脱色效果的影响

在酶解温度为50 ℃、酶解时间为10 min和pH为7.0的固定条件下，改变加酶量分别为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，探讨加酶量对葵花籽蛋白脱色效果的影响，其结果如图1所示。由图1可知，在加酶量0.6%～0.8%之间，葵花籽蛋白的L*值不断提高，加酶量为0.8%的时候葵花籽蛋白的L*值达到最高，因此一定的酶添加量有利于脱除绿原酸从而改善葵花籽蛋白质的颜色，在其他条件保持不变的情况下，随着酶添加量的增加，葵花蛋白L*值呈急速下降趋势，脱色效果降低，故选择加酶量为0.8%。

2.3 正交实验结果分析

在单因素实验的结果分析基础上，选择酶解温度、pH、酶解时间、加酶量为考察因素，以白度值(L*)为考察指标，进行正交实验，正交实验方案设计及结果分析表见表3。从表3中比较极差R值大小可知，影响葵花籽蛋白脱色效果的各因素主次顺序分别为B(酶解时间)>A(pH值)>C(酶解温度)>D(加酶量)。通过正交实验得到最佳脱色工艺条件为：酶解时间10 min、酶解pH 6.0、酶解温度55 ℃、酶添加量0.8%，在此条件下葵花籽蛋白的L*值为84.5、a*值2.7、b*值12.6。

表3 正交试验方案设计及结果分析表

2.4 限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色对葵花籽蛋白得率及含量的影响

葵花籽蛋白和限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的得率及蛋白质含量见表4，由表4可知，与葵花籽蛋白相比，限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色的葵花籽蛋白的得率和蛋白质含量都明显提高，这可能是由于一方面限制性酶解之后导致蛋白结构发生改变，结构伸展，疏水基团暴露，加快了溶剂的渗透效率，从而提高了蛋白质得率。另一方面，适宜的pH和NaCl浓度会降低蛋白和多酚类物质的氧化作用，从而提高蛋白产量。Pickardt等[14]在pH 6和1.3 mol/L NaCl条件下采用XAD-16大孔树脂进行吸附条件下提取低酚葵花籽蛋白，发现不仅可以改善葵花籽蛋白颜色，还能有效提高蛋白得率。

表4 限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色对葵花籽蛋白得率及含量的影响

2.5 限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色对葵花籽蛋白功能特性的影响

溶解性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性和持油性及持水性都是蛋白质重要的功能特性，在焙烤食品、饮料及肉制品等食品工业中具有重要作用，葵花籽蛋白和限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的功能特性见表5。

由表5可知，与未脱色葵花籽蛋白相比，限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色对葵花籽蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性、起泡性和持水性都显著提高(P<0.05)，这可能是由于限制性酶解后蛋白质的结构发生伸展，分子量降低，蛋白质更容易在界面扩散，界面的吸附能力加强，使得疏水性基团具有亲水亲油性，所以蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性、起泡性和持水性都增强了，限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的持油性及泡沫稳定性略低于未脱色葵花籽蛋白，这可能是由于限制性酶解产生的小肽不足以维持泡沫的稳定，导致酶解产物的泡沫稳定性降低了，另一方面由于限制性酶解破坏了蛋白原有的结构，减弱了其物理包覆能力，蛋白的吸附能力降低，最终导致持油性降低。Jin等[20]使用胰蛋白酶对核桃蛋白进行限制性酶解后发现其溶解性、乳化性、起泡性均显著提高。限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色处理可以提高葵花籽蛋白的功能特性。

表5 限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色对葵花籽蛋白功能特性的影响

3 结论

在单因素实验基础上进行四因素三水平的正交实验分析，优化葵花籽分离蛋白的脱色工艺条件，正交试验分析得出：限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色的最佳工艺参数为酶解时间10 min、酶解pH 6.0、酶解温度55 ℃、酶添加量0.8%。在此条件下葵花籽蛋白的白度值(L*)为84.5、a*值2.7、b*值12.6，蛋白质质量分数和得率分别为(97.65±0.23)%和(7.22±0.02)%，葵花籽蛋白颜色由深灰色变为浅白色，脱色效果显著。限制性酶解结合大孔树脂吸附脱色葵花籽蛋白的溶解度、起泡性及起泡稳定性和乳化性及乳化稳定性均得到显著提高(P<0.05)，持油性和泡沫稳定性降低，限制性酶解结合大孔树脂吸附不仅对葵花籽蛋白脱色具有显著效果，还对葵花籽蛋白的功能特性的提升有显著的影响。该工艺可以促进葵花籽粕加工的开发，满足食品工业在寻找大豆蛋白以外的优质植物蛋白方面的要求。